Servicio de preparación de anticuerpos policlonales

Servicio de preparación de anticuerpos policlonales

Proceso general de preparación de anticuerpos múltiples: * preparación de antígenos - + inmunidad del conejo - → detección de potencia y liberación final - + purificación de afinidad de anticuerpos - + concentración y conservación de anticuerpos.

Los pasos experimentales específicos son los siguientes:

1. preparación del conejo

Seleccione dos conejos blancos neozelandeses sanos de 6 semanas (unos 2 kg) para adaptarlos al nuevo entorno de vida y estabilizarlos al menos unos días antes de * tomar sangre y precosechar sangre (como referencia negativa)

1.1 colocar cuidadosamente al conejo en un estante fijo para calmarlo;

1.2 afeitarse cuidadosamente el pelo de las orejas del conejo para que los vasos sanguíneos sean claramente visibles (también sin afeitarse);

1.3 si es necesario, se puede aplicar una pequeña bola de algodón con alcohol en el lugar de los vasos sanguíneos para hincharlos;

1.4 extraer unos 10 ml de sangre (unos 5 ml de suero) de la vena del oído con una jeringa;

1.5 retire cuidadosamente la aguja, presione adecuadamente la herida para evitar el sangrado, y luego desinfecte la herida con bolas de algodón alcohólicas;

1.6 inactivar la sangre recogida en 37 c durante 30 minutos y luego colocarla en 4 'c durante la noche para que se coagule y libere suero;

1.7 centrifugar la sangre condensada durante 10.000 R / MIN durante 10 minutos; H. recoger el suero superior, es decir, el suero.

Inmunidad del conejo

2.1 La inyección de dos conejos tiene un antígeno de 1 ml, y la solución tampón antigénica debe estar libre de reactivos químicos dañinos para los conejos. es más adecuado inmunizar a los conejos con un antígeno de 400 ug por primera vez, o puede reducirse adecuadamente para obtener mejores resultados. la inmunización posterior es de 100 ug por vez.

2.2 mezclar completamente el adyuvante foer * de 1 m con el antígeno preparado de 1 m, que es blanco lechoso; .

2.3 extraer cuidadosamente el conejo de la jaula, tejer el conejo inmuniza cuatro partes (tanto la espalda como las raíces del muslo), 250ul en cada parte, la aguja se inserta en un ángulo de 45 grados en 1 - 2 cm por debajo de la piel, y permanecer unos segundos después de la inyección para evitar la salida de antígenos.

2.4 El ciclo epidémico del conejo es de 20 días, y la extracción de sangre (incluida la extracción de sangre a mitad de camino y la liberación final) se realiza de 7 a 10 días después de la inmunización, con un total de 4 - 5 inmunizaciones.

3. prueba de potencia

3.1 dos referencias negativas de referencia son suero sanguíneo preestablecido, todos diluidos con una concentración anti - inicio (diluyente cerrado); La referencia positiva es anterior

Suero positivo

3.2 añadir 100 ul, antígeno 1ug / m por gotero de 96 agujeros en la placa, pasar la noche a 49c o incubar a 37 ° C durante 2 horas.

3.3 verter la solución de antígeno, añadir 200 u de solución de cierre por agujero, 49c durante la noche o 379c incubar durante 2 horas.

3.4 vierte el líquido de cierre, golpea el papel absorbente de agua para secar el líquido residual tanto como sea posible, lava la placa con detergente tres veces cada vez para secar el líquido residual tanto como sea posible, si quieres colocarlo durante un período de tiempo, secarlo a 37 ° C y sellarlo con un bolsillo sellado para almacenarlo a 20 ° c.

3.5 recoger la placa de 96 agujeros cubierta,第---Se añaden 100 ul de líquido de referencia negativo en el agujero, 100 ul de líquido de referencia positivo en el segundo agujero y 1: 500 de suero a medir en el tercer agujero. posteriormente, los agujeros se diluyen sobre esta base y se incuban a 37 ° C durante 1 hora.

3.6 verter el líquido, lavar la placa con detergente tres veces y secar. Los ratones marcados con HRP de 100 u por agujero fueron resistentes a la LGG de conejo (diluidos a 1: 2000) e incubados a 37 ° C durante 45 minutos.

3.7 verter el líquido, lavar la placa con detergente tres veces y secar. El sustrato tmb (tmb de un solo componente de sigma) con 100 u por agujero se incuba a 37 ° C durante 5 - 20 minutos (el tiempo de desarrollo del color se determina en función de la profundidad del color).

3.8 añadir 50 u de líquido de terminación (2n h2so4) por agujero y leer el valor de absorción de luz a una longitud de onda de 450 nm en el medidor de estándar enzimático.

Después de que la prueba de título de anticuerpos alcance más de 1 millón, se puede realizar la liberación final de sangre del conejo.

Purificación de anticuerpos

4. afinidad de los anticuerpos - preparación de columnas de afinidad

4.1 pesar el gel de agarosa de 1 mg de cnpr - severo 4b y añadir 2 mmol / L de ácido clorhídrico, 4 'c durante la noche lo disuelve completamente y puede obtener 3 mmol de gel disuelto.

4.2 transferir el gel a la columna de purificación y lavar el Medio con aproximadamente 20 ml de ácido clorhídrico 2 mmol / l tres veces.

4.3 lavar el Medio con un amortiguador de acoplamiento - veces, debido a que el Grupo activado es fácil de hidrolizar a un valor de pH del amortiguador de acoplamiento, este pasoSe completa en unos minutos.

4.4 añadir 5 - 10 mg de antígenos disueltos en 5 ml de tampón de acoplamiento al gel

4.5 mezclar y sacudir suavemente a temperatura ambiente durante 2 - 4 horas, o 4 'c durante la noche, si es necesario determinar la eficiencia de Unión después de este paso, tome una pequeña cantidad de solución para medir. Lave el Medio una vez con 20 ml de tampón de acoplamiento.

4.6 añadir una solución BSA de 15 M1 1% a temperatura ambiente para incubar durante 2 horas o 4 'c durante la noche.

4.7 lavar el medio más de tres veces con un amortiguador de fosfato, cada vez por encima de 15 m H.

4.8 La fase sólida del antígeno se completa y se puede utilizar para la purificación.

4.9 si no se usa o se usa inmediatamente, se sella con un 20% de etanol.

5. purificación y conservación del antisuero

5.1 El antisuero se diluye con PBS y otros volúmenes, se centrifuga entre 5000 y 10000 / MIN durante 15 minutos y se extrae el líquido superior.

5.2 limpiar la columna de afinidad de antígenos con PBS de 10 veces el volumen para equilibrar la columna.

5.3 añadir el antisuero diluido 10m a la columna equilibrada.

5.4 mezclar suavemente y sacudir durante 2 - 4 horas a temperatura ambiente o pasar la noche a 4 'c

5.5 limpiar la columna de antígenos con 10 veces el volumen de PBS para lavar las proteínas misceláneas adheridas a la columna

5.6 lavar la columna con un eluyente de anticuerpos de doble volumen para obtener anticuerpos específicos

5.7 columnas equilibradas con PBS de 10 veces el volumen

5,8 columnas selladas con un 20% de alcohol y conservadas en 4 'c.

Después de obtener el anticuerpo eluido, se dializó y desalinizó en PBS después de la concentración de sacarosa o peg, y se utilizó un espectrómetro visible ultravioleta para determinar el valor de od del anticuerpo a una longitud de onda de 280 nm. el valor de od obtenido se dividió por 1,35 como la concentración del anticuerpo medido, añadiendo 40 - 50% de glicerina a 20 ° C para su conservación a largo plazo.

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