Kit de Elisa de ratón IL - 1beta (il - 1beta)

1.Tipo de muestra y recogida:

Suero:Colocar a temperatura ambiente muestras de sangre entera recogidas en el tubo de separación de suero0,5 -2Horas o4℃Pasar la noche y luego1000×gCentrifugadora20 Minutos, basta con sacar el Qing o colocarlo-20℃O-80℃Conservar, pero evitar la congelación y descongelación repetidas.
Plasma:ConEDTAO Heparina como anticoagulante para recoger las muestras y las muestras después de la recolección.30En minutos2 - 8℃ 1000×gCentrifugadora15Minutos, se puede detectar con la parte superior del qing, o se puede colocar la parte superior del Qing en-20℃O-80℃Conservar, pero evitar la congelación y descongelación repetidas.

Homogeneización del tejido:Con preconfriadoPBS (0,01 M, pH=7,4)Lavar el tejido, eliminar la sangre residual (los glóbulos rojos agrietados en el homogeneizado pueden afectar los resultados de la medición), y después del pesaje, el tejido cortado se compara con el volumen correspondiente.PBS(generalmente por1: 9Relación peso - volumen, por ejemplo1 gramoLas muestras de tejido corresponden a9 mldePBSEl volumen específico se puede ajustar adecuadamente de acuerdo con las necesidades del experimento y registrarlo bien. Recomendado enPBSAñadir un inhibidor de la proteasa) al homogeneizador de vidrio y moler completamente sobre el Hielo. Para romper aún más los tejidos y las células, el homogeneizado se puede triturar por ultrasonido o congelar y descongelar repetidamente. Finalmente, se homogeneizó en5000×gCentrifugadora5 a 10Minutos,Se puede detectar tomando el claro,O colocar la parte superior de la Qing en-20ºC o-80Conservar a ℃, pero se debe evitar la congelación y descongelación repetidas.

Lisado celular: Aspirar y abandonar el medio de cultivo, usarEl PBS (0,01 m, pH 7,4) lava las células. Raspar la célula con la célula y agregar 2 - 5 ml de PBS (0,01 m, pH 7,4). Las células suspendidas se pueden omitir. Recoger la suspensión celular, centrifugar a 4 ° C 1000 × G durante 10 minutos, descartar el medio de cultivo y humedecer con PBS preconfriado tres veces. Añadir una cantidad adecuada de PBS preconfriados o lisados celulares no degenerativos (añadir inhibidores de proteasa antes de la aplicación temporal) para suspender las células, por lo general, el número de células de un agujero en una placa de 6 agujeros requiere 150 - 250 μl de PBS para suspender las células. Poner la muestra a - 20 ° c o - 80 ° c, congelar la muestra, luego descongelarla a temperatura ambiente, congelar y descongelar repetidamente la muestra tres veces, para que la célula se rompa completamente, también se puede triturar la muestra por ultrasonido para lograr el propósito de la lisis. Centrifugación a 4 ° C 10.000 × G durante 10 minutos, eliminando los fragmentos celulares, se puede detectar con un suero,O colocar la parte superior de la Qing en-20ºC o-80Conservar a ℃, pero se debe evitar la congelación y descongelación repetidas.

Sobrenadante de cultivo celular u otros especímenes biológicos:Por favor1000×gCentrifugadora20Minutos, se puede detectar con la parte superior del qing, o se puede colocar la parte superior del Qing en-20ºC o-80Conservar a ℃, pero se debe evitar la congelación y descongelación repetidas.

2.Conservación y estabilidad de las muestras

La muestra está en2 - 8℃En condiciones, se puede almacenar72h， En- 20℃O-80℃Se puede almacenar6 meses yarribaDespués de la recogida de la muestra, no se completa una prueba, por favor, empaque y congele de acuerdo con la dosis una vez para evitar la congelación y el deshielo repetidos.

Pasos:

1. Número: las muestras se numeran en orden con los microporos correspondientes, y cada placa debe tener un control negativo.2 agujeros, 2 agujeros de control positivo y 1 agujero de control en blanco (el agujero de control en blanco no agrega muestras ni reactivos estándar enzimáticos, y el resto de los pasos son los mismos.(...).

2. Añadir muestra: añadir control negativo y control positivo en el agujero de control negativo y positivo, respectivamente.50μl。 Luego, se agrega un diluyente de muestra de 40 μl al agujero de la muestra a medir, y luego se agrega una muestra a medir de 10 μl. Añadir la muestra a la parte inferior del agujero de la placa estándar de la enzima, tratar de no tocar la pared del agujero, sacudir suavemente y mezclar bien.

3. Wen yu: detrás de la placa de sellado con película de placa de sellado37Temperatura Celsius 30minuto.

4. Distribución de líquidos: se30 veces el detergente concentrado se diluye con agua destilada 30 veces y se reserva.

5. Lavado: retire cuidadosamente la película de sellado y abandone el líquido,Tirar seco, llene cada agujero con detergente y deje reposarAbandonarlo después de 30 segundos, repetirlo 5 veces así y disparar seco.

6. Adición de enzimas: añadir reactivos estándar de enzimas a cada agujero50μl， Excepto agujeros en blanco.

7. Wen yu: detrás de la placa de sellado con película de placa de sellado37Temperatura Celsius 30minuto.

8. Lavado: retire cuidadosamente la película de sellado y abandone el líquido,Tirar seco, llene cada agujero con detergente y deje reposarAbandonarlo después de 30 segundos, repetirlo 5 veces así y disparar seco.

9. Color: añadir el agente de color primero a cada agujeroA50μl, y luego agregue el agente de colorB50μl, agitar suavemente y mezclar bien,37℃ evitar la luz y mostrar color 10-20Min.

10.Terminación: cada agujero más terminaciónlíquido50 μl, terminar la reacción(en este momento, el azul se pone de pie y se vuelve amarillo).

11.Determinación: ajustar a cero con agujeros en blanco,450nmLa longitud de onda se mide secuencialmente en cada agujero.Absorción de luzGradosODValor). La determinación debe hacerse después de agregar el líquido de terminación15Se llevará a cabo en menos de minutos.

Atención:

1. Preparación del kit: el kit se extrae del ambiente refrigerado y debe equilibrarse a temperatura ambienteSolo se puede usar en 15 - 30 minutos. Preparar la tira estándar de la enzima necesaria para un experimento, el resto se puede quitar de la placa microporosa, sellarla y conservarla de acuerdo con las instrucciones para su próximo uso.

2. Añadir muestra: en la operación experimental, use una cabeza de succión de esterilización desechable para evitar la contaminación. Al agregar la muestra, preste atención a no producir burbujas de aire, agregue la muestra a la parte inferior de la placa estándar de la enzima, trate de no tocar la pared del agujero, agite suavemente y mezcle bien. Al igual que la adición de reactivos de reacción, el intervalo de tiempo entre el primer agujero y el último agujero en el proceso de adición de muestra es lo más pequeño posible (generalmente controlado enDentro de los 10 minutos), si es demasiado grande, dará lugar a diferentes tiempos de "calentamiento previo", lo que afectará significativamente la precisión y repetibilidad de los valores medidos. Para la precisión de los valores medidos, se recomienda establecer agujeros compuestos para experimentos.

3. Educación caliente: para evitar la evaporación de la muestra, durante el experimento, coloque la placa estándar enzimática cubierta o cubierta en una caja húmeda para evitar la evaporación del líquido. después de lavar la placa, debe realizar el siguiente paso lo antes posible. en cualquier momento, debe evitar que la placa estándar enzimática esté seca, respetando estrictamente el tiempo y la temperatura de educación caliente dados.

4. Lavado:Detergente concentradoposibleHabráCristalizaciónPrecipitación, que se puede calentar y ayudar a la disolución en un baño de agua cuando se diluye, no afecta el resultado al lavarse. Es muy importante lavarse completamente, y en cada proceso de lavado, hay que secar el detergente. Durante el proceso de lavado, el líquido de lavado residual en el agujero de reacción debe secarse sobre el papel absorbente, no poner el papel absorbente directamente en el agujero de reacción para absorber el agua, y limpiar suavemente el líquido residual en el Fondo de la placa y las huellas dactilares para evitar afectar la lectura final del medidor enzimático. Si se utiliza una lavadora automática de placas, se debe usar hábilmente antes de usarlo durante el experimento formal.

5. Control del tiempo de reacción: después de agregar el sustrato, observe regularmente el cambio de color del agujero de reacción. si se observa un color más oscuro, agregue el líquido de terminación con antelación para detener la reacción y evitar que la reacción sea demasiado fuerte y afecte la lectura de la densidad óptica del medidor enzimático.

6. Sustrato: el sustrato debe conservarse protegido de la luz y evitar la exposición directa a la luz fuerte durante el almacenamiento y el calentamiento.