Detección de hibridación in situ

NegociableActualización en05/06

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Descripción general

El principio básico de la detección de hibridación in situ es utilizar secuencias de bases complementarias entre cadenas individuales de moléculas de ácido nucleico, emparejar ácidos nucleicos exógenos radiactivos o no radiactivos (es decir, sondas) con ADN o ARN a detectar en tejidos, células o cromosomas, formar moléculas híbridas de ácido nucleico específicas y mostrar la posición de los ácidos nucleicos a detectar en tejidos, células o cromosomas por ciertos medios de detección.

Detalles del producto

Métodos y pasos experimentales de Fish

I. Degeneración de la sonda

La sonda se crió a temperatura ambiente en un baño de agua a temperatura constante de 75 ° C durante 5 minutos, y se colocó inmediatamente en 0 ° C durante 5 a 10 minutos para desnaturalizar la sonda de ADN de doble cadena.

II. Degeneración de especímenes

① hornear las láminas de vidrio preparadas de 5 - 8 um en una incubadora de 50oc durante 2 a 3 horas (las muestras teñidas por Giemsa deben desvanecerse en un líquido fijo antes de hornear las láminas).

② extraer el espécimen de vidrio y sumergirlo en una solución desnaturalizada con una fracción de volumen del 70% a 75 oc, Formamida / 2 × ssc, y desnaturalizarlo durante 2 a 3 minutos.

③ deshidratar inmediatamente las muestras en orden por una serie de etanol helado con una puntuación de volumen del 70%, una puntuación de volumen del 90% y una puntuación de volumen del 100%, 5 min cada vez, y luego secarlas al aire.

3. Hibridación

Gotear 10 μl de sonda de ADN desnaturalizada o prealimentada sobre un espécimen de vidrio desnaturalizado y deshidratado, cubrir con 18 × 18 vidrios y sellar con parafilm, y colocarlo en una caja húmeda para cruzar 37oc durante la noche (aproximadamente 15 a 17 h). Debido a que el líquido híbrido es menor y la temperatura del híbrido es alta y la duración es larga, para mantener el estado húmedo del espécimen, este proceso se lleva a cabo en una caja húmeda.

4. Elución

Este paso ayuda a eliminar las sondas que no se unen específicamente, reduciendo así el fondo.

(1) al día siguiente de la hibridación, se extrae el espécimen de la incubadora de 37oc y se retira suavemente la lámina de vidrio con una cuchilla.

(2) colocar las muestras de vidrio híbridas en una fracción de volumen del 50% de Formamida / 2 × SSC precalentada de 42 a 50 ° C para lavarlas tres veces, 5 min cada vez.

(3) lavar 3 veces en 1 × SSC que ha sido precalentado de 42 a 50 ° c, 5 min cada vez.

(4) a temperatura ambiente, lave ligeramente el espécimen de vidrio en 2 × ssc.

(5) retire las rodajas de vidrio y seque naturalmente.

(6) tomar 200 μl de solución de redescuento (pi / anifade o dapi / anifade) y gotear sobre el espécimen de vidrio y cubrirlo con una cubierta de vidrio.

V. Observación de los resultados de Fish con microscopio fluorescente

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