Fluorescente de escaneo diferencial de alto rendimiento supr - DSF

Estabilidad de las proteínas

La estabilidad de las proteínas es uno de los atributos de calidad clave importantes de los medicamentos biotecnológicos, que determina la eficacia, viabilidad de producción, seguridad y vida útil de los medicamentos biotecnológicos. La estabilidad estructural avanzada de las proteínas garantiza que las proteínas mantengan su actividad y Seguridad durante su vida útil.

El estudio de estabilidad se utiliza para confirmar la estabilidad de la estructura avanzada hos (estructura de orden alto) de la proteína en diferentes condiciones, como temperatura, ph, composición de accesorios y tiempo de almacenamiento, para determinar las condiciones adecuadas de almacenamiento y transporte. Al mismo tiempo, los reguladores como la FDA y la EMA también requieren amplios datos de estabilidad antes de autorizar la aprobación del uso de medicamentos biológicos. Por lo tanto, comprender y garantizar la estabilidad estructural avanzada de los medicamentos proteicos terapéuticos es una condición necesaria para que las empresas biofarmacéuticas desarrollen medicamentos seguros y efectivos, y los investigadores deben analizar y evaluar la estabilidad estructural avanzada de las proteínas en varias etapas de investigación y desarrollo y producción.

Métodos comunes de análisis de la estabilidad de las proteínas

El análisis de estabilidad de las proteínas suele estudiarse utilizando los siguientes métodos:

Métodos bioquímicos

Dichromatografía circular (cd, circular dichroism spectrocopy)

Método de escaneo diferencial (dsc)

Técnica de PCR cuantitativa (qpcr) (dsf fluorescente exógeno)

Dispersión dinámica de la luz (dls) y métodos de dispersión estática de la luz (sls)

El método de espectrometría de barrido diferencial (dsc) se utiliza a menudo como la solución más importante para el análisis de estabilidad de proteínas, sin embargo, la aplicación del DSC en el cribado de medicamentos y el desarrollo temprano está sujeta a ciertas restricciones debido a la demanda de análisis rápido de un gran número de muestras almacenadas en microporos, como 96 o 384 microporos. Por lo tanto, el DSF (método de fluorescencia endógena) se ha convertido en una solución popular y rentable.

El DSF (método de fluorescencia endógena) no requiere ninguna marca de la muestra medida ni ninguna sonda fluorescente para medir rápidamente la placa microporosa de la muestra entera y proporcionar datos de alto rendimiento para ayudar a la selección de candidatos a la muestra y componentes de fórmula.

El método DSF selecciona rápidamente un gran número de muestras, lo que mejora en gran medida la eficiencia del cribado de medicamentos y el análisis de la formación de fármacos, y los resultados del análisis y la tecnología DSC se verifican ortonormal entre sí. Para muchos medicamentos biotecnológicos, el uso del método DSF como un cribado rápido y masivo, el uso de la tecnología DSC para verificar ortogonal los resultados del cribado temprano de dsf, es una solución eficaz para el cribado de medicamentos y el desarrollo de medicamentos.

Principios de la tecnología dsf:

La fluorescencia de barrido diferencial (dsf) es una técnica biofísica económica, eficiente y fácil de usar que determina la temperatura de Transición de desnaturalización (valor de la temperatura de transición térmica TM o valor de la desnaturalización química cm) de una proteína detectando los cambios correspondientes en el espectro de emisión de fluorescencia cuando aumenta la temperatura o existe un desnatural.

El estudio encontró que los aminoácidos del anillo aromático en las moléculas de proteínas se desplazan en el espectro máximo de emisión de su fluorescencia endógena estimulada cuando se encuentran en microambientes de diferentes polaridades, como en entornos hidrofóbicos o hidrofílicos. La fluorescencia endógena en las proteínas proviene principalmente de aminoácidos que contienen anillos aromáticos como el triptófano (trp), la fenilalanina (phe) y la tirosina (tyr), de los cuales la fluorescencia endógena del triptófano es Fuerte.

En el caso del triptófano, en el microambiente nuclear hidrofóbico de la proteína, la longitud máxima de emisión de fluorescencia endógena es de unos 330 nm, mientras que en el microambiente polar hidrofílico, la longitud máxima de emisión de fluorescencia endógena del triptófano aparece en unos 350 nm. La desnaturalización térmica o química de las proteínas suele provocar cambios en la polaridad del microambiente circundante a los residuos de triptófano, exponiendo gradualmente al triptófano, que suele estar enterrado en el núcleo hidrofóbico de la proteína, a entornos hidrofílicos, lo que provoca un desplazamiento al rojo de la longitud máxima de onda emitida por fluorescencia endógena (red shift), es decir, un movimiento hacia una región de longitud de onda más grande.

Este método de monitoreo de cambios en la fluorescencia endógena del triptófano no requiere sondas o etiquetas fluorescentes, evitando resultados falsos positivos como la fluorescencia de fondo y la adsorción no específica en el DSF fluorescente exógeno tradicional.

Cuando las proteínas se desdoblan debido a la desnaturalización térmica o la acción de desnaturalizadores químicos como el clorhidrato de guanidina, la urea, etc., se puede estudiar el proceso de desarrollo de las proteínas midiendo la fluorescencia endógena con los cambios de temperatura o desnaturalizadores. Los datos de estos cambios se pueden utilizar para generar curvas de fusión y obtener valores de temperatura de transición térmica aparente tm, Tonset、 La variación de la Entalpía de Van der Waal (△ h), la energía libre de Gibbs (△ g), los valores de cm de desnaturalización química, etc., se utilizan para evaluar y predecir la estabilidad de las proteínas.

El DSF tradicional utiliza a menudo el método de relación 350 / 330 para el análisis de datos, mientras que el supr - DSF proporciona una variedad de métodos de análisis, además del método de relación, el supr - DSF también proporciona BCM (barycentric significa, método de media centroide), que puede obtener una mejor relación señal - ruido que el método de relación 350 / 330, al tiempo que es más propicio para el análisis de muestras de proteínas de baja concentración.

Fluorescente de escaneo diferencial de alto rendimiento supr - DSFLas principales características del sistema:

Con una placa microporosa estándar 384, no se necesitan consumibles y capilares especiales

Selección de alto rendimiento, un proceso de calentamiento (60 - 80 minutos) se puede completar en

La prueba de una sola placa microporosa 384 utiliza fluorescencia endógena, sin colorantes ni etiquetas, compatible con la excitación ultravioleta LED del sistema biológico común y la detección espectral completa.

Solo se necesitan muestras de 10 - 30 μl, con una concentración de muestra de 0,05 a 250 mg / ML.

Se obtienen parámetros clave: tonset, tm, △ heng, △ g, cm y afinidad, etc.

Proporcionar calidad de datos rigurosa y repetibilidad

Fluorescente de escaneo diferencial de alto rendimiento supr - DSFAplicación del sistema:

El sistema supr - DSF es ampliamente utilizado en muchos campos, como la investigación básica en Ciencias de la vida y la investigación y el desarrollo de medicamentos:

Acelerar el cribado de mutantes

Selección y optimización de fórmulas y preprocesadores

Selección de las condiciones de cristalización de proteínas

Evaluación de la coherencia entre lotes

Evaluación de la similitud biológica

Estudio sobre el estrés acelerado y la degradación forzada

Análisis de los cambios conformacionales inducidos por la Unión

Evaluación de modificaciones posttraduccionales

Análisis de temperatura constante y estabilidad química

Especificaciones técnicas del sistema supr - dsf:

Casos de aplicación típicos:Acelerar el cribado de mutantes

Se compararon y seleccionaron 16 muestras con supr - dsf, entre ellas una proteína de tipo salvaje (wt) y 15 mutantes de un solo punto. En 1,5 horas, el instrumento DSF generó una curva de fusión de alta calidad de 48 muestras (3 repeticiones por grupo) (datos que pueden generar hasta 384 agujeros en el mismo tiempo). Los datos se ajustan con el modelo, que puede obtener el valor de la temperatura de fusión Tm y ordenar y filtrar la estabilidad.

Como se muestra en la figura 1, la curva de fusión de tres de los mutantes (9, 13 y 14) se desplazó a la izquierda en comparación con WT (azul), lo que indica una menor estabilidad proteica; La estabilidad de los 12 mutantes restantes ha mejorado. Entre ellos, los mutantes 1, 8 y 12 tuvieron la mayor mejora de estabilidad.

La figura 2 muestra la curva de fusión de varias muestras representativas, donde se pueden encontrar procesos de transición térmica única en algunas proteínas (wt con mutantes 7 y 8), mientras que otras (mutantes 1 y 14) muestran claramente dos procesos de transición térmica, es decir, hay dos puntos de inflexión en la curva de fusión. Los datos proporcionados por supr - DSF pueden ayudar a los investigadores a seleccionar candidatos prometedores para una investigación en profundidad.

Análisis preciso de la región FAB del Anticuerpo monoclonal

Los datos de fluorescencia de escaneo diferencial de nistmab (estándar de Anticuerpo monoclonal nist) se obtuvieron utilizando supr - DSF y los resultados se compararon con los obtenidos por la metrología de escaneo diferencial (dsc). El supr - DSF puede analizar todos los tres dominios del nistmab: ch2 (69 ° c), ch3 (83 ° c) y la región FAB (94 ° c). la temperatura máxima de escaneo del supr - DSF es de 105 ° c, lo que permite medir con precisión la temperatura de fusión de la región FAB anormalmente estable, mientras que la temperatura máxima de escaneo de otras plataformas DSF es generalmente de solo 95 ° c, lo que facilita la pérdida de información importante sobre la desnaturalización de la región FAB del Anticuerpo monoclonal (figura 5 (a).

Los datos normalizados de supr - DSF se compararon con los resultados de dsc. Como se muestra en la figura 5 (b), los tres picos coinciden entre sí, demostrando una buena consistencia entre las dos técnicas, y el uso de supr - DSF puede obtener fácilmente información de estabilidad proteica de alta calidad.

Casos de aplicación típicos - acelerar la selección de accesorios y fórmulas de Trastuzumab

Las fórmulas de medicamentos bioterapéuticos como los anticuerpos son la base para garantizar la eficacia, la viabilidad de la producción y la seguridad, y también determinan las condiciones de almacenamiento y transporte. Las empresas farmacéuticas necesitan urgentemente métodos de alto rendimiento para seleccionar de manera rápida y confiable un gran número de combinaciones de condiciones para determinar la mejor fórmula.

Con supr - dsf, los investigadores seleccionaron y analizaron la estabilidad del anticuerpo terapéutico Trastuzumab en 96 condiciones diferentes y completaron la prueba en 1,5 horas. Los resultados de la prueba son muy consistentes con los resultados del método de escaneo diferencial (dsc). Si se integran equipos de automatización de laboratorio, se pueden completar miles de selecciones de muestras al día.

La curva de fusión DSF muestra dos áreas de transformación independientes, y el ajuste de los datos a través del método de mínimos cuadrados permite determinar el valor tonset, el valor Tm y el cambio de Entalpía de Van der Waal (△ h). la figura 3 (a, b) muestra la curva de fusión y el gráfico de ajuste de los accesorios que destruyen / mejoran la estabilidad, respectivamente. La figura 4 (a) enumera todos los accesorios que pueden mejorar la estabilidad de los anticuerpos (en comparación con las muestras de control).

El supr - DSF identifica correctamente el efecto estabilizador de los accesorios utilizados en Trastuzumab comercializado, Histidina y trehalosa, como se muestra en la figura 4 (b), y los datos del suprsf tienen una excelente fiabilidad y consistencia, al tiempo que ofrecen un rendimiento sorprendentemente alto.

Utilizando el método de fluorescencia de escaneo diferencial de alto rendimiento para obtener parámetros de unión

La investigación analítica combinada es un área clave en el desarrollo de fármacos. las características de interacción y los valores KD (constantes de equilibrio de disociación, que caracterizan la afinidad de la Unión intermolecular) son esenciales para la selección de candidatos. los investigadores necesitan utilizar múltiples métodos de complementariedad de principios para seleccionar e identificar entre miles y decenas de miles de compuestos de moléculas pequeñas en la biblioteca.

El análisis de interacción molecular a través del supr - dsf, que no se ve afectado por factores como los efectos superficiales, la migración de sustancias (mass transport) o los problemas de refracción del amortiguador, puede proporcionar mediciones de alto rendimiento y sin marcar dentro del rango de concentración de Unión del analito.

Al detectar cambios en la estabilidad del complejo de ligandos de proteínas, se puede utilizar para confirmar la especificidad de la unión; Los valores de KD se pueden calcular a través de la relación funcional entre los cambios en el espectro de emisión de fluorescencia durante la desnaturalización térmica y la concentración del ligando. Incluso para moléculas de unión muy débiles, los cambios de estabilidad inducidos por la Unión pueden ser detectados por supr - dsf.

Utilizando una placa microporosa estándar 384, se puede seleccionar la estabilidad de miles de muestras en un día, confirmando así el Estado de unión.

Utilizando supr - DSF para estudiar la Unión del ligando (tfmsa) a la anhidrasa carbónica humana i, la curva de fusión de la anhidrasa carbónica con la concentración de tfmsa se muestra en la figura 6.

La figura 7 muestra la relación entre los valores de Tm de la anhidrasa carbónica humana I y la concentración de tfmsa, y los valores de KD obtenidos por el ajuste son dos, 2,1 y 174,2, respectivamente, y

Los valores en la literatura son consistentes, demostrando que el supr - DSF puede usarse como una herramienta de preexamen o confirmación para estudios de Unión de ligandos y tiene sensibilidad.

Software intuitivo y conciso

El software supr - DSF proporciona funciones intuitivas, concisas, inteligentes y eficientes de diseño experimental y análisis de datos, que no sólo permiten a los principiantes comenzar rápidamente, sino que también ofrecen una variedad de opciones avanzadas para usuarios veteranos experimentados.

Sobre proteinstable

Filial de Applied photophysics, tiene como objetivo introducir tecnologías centradas en el cliente en el mercado de cribado y caracterización de proteínas, centrándose en métodos de caracterización de proteínas de alto rendimiento y bajo volumen de muestras, mejorando la productividad sin afectar la calidad de los datos.

Sobre appledphotophysics

La Compañía Británica de fotofísica aplicada applied photophysics ha proporcionado programas profesionales para la investigación estructural y funcional de medicamentos biológicos durante décadas. los productos incluyen espectrómetro de CD Dicolor circular, analizador de dinámica de reacción de flujo detenido, analizador de estabilidad de proteínas supr DSF

Espera. Los usuarios se encuentran en las principales universidades e instituciones de investigación científica y compañías farmacéuticas de todo el mundo.

El espectrómetro de CD bicolor circular de la serie chirascan es ampliamente utilizado en la caracterización estructural avanzada de medicamentos biológicos como proteínas, incluyendo el análisis estructural secundario y terciario de proteínas, así como el estudio de la estabilidad térmica de la estructura secundaria y la estabilidad térmica de la estructura terciaria.