Kit de expresión de proteínas acelulares - versión mejorada con enlace disulfido - polvo liofilizado

Número de artículo：P0243L

Condiciones de almacenamiento:-80℃，1añoefectivo

Transporte de hielo seco. Después de la apertura, el componente de reacción de expresión de proteínas acelulares se almacenó a - 80 ℃. Para evitar la congelación y el deshielo repetidos, de acuerdo con la cantidad de reacción, el líquido a y el líquido B se pueden dividir y congelar rápidamente con nitrógeno líquido antes de almacenarlo a - 80 ℃.

Componentes del producto

Descripción del producto

El kit de síntesis de proteínas acelulares (cell - free Protein Synthesis kit) es unUn producto basado en el lisado celular de E. coli para la síntesis de proteínas in vitro. El producto se utilizaSustancias activas como ribosomas, factores de traducción y enzimas en el lisado celular, complementando la energía al mismo tiempo,Nucleótidos, aminoácidos, sales inorgánicas, etc., que reconstruyen la transcripción in vitro- sistema de traducción. Con ADN oEl ARN es una plantilla que expresa proteínas. La expresión de proteínas acelulares es una bacteria que no depende de la vida,Puede expresar proteínas en grandes cantidades de manera rápida y flexible, y es popular en comparación con los sistemas de expresión recombinantes tradicionales.Múltiples ventajas:

1. la expresión de la proteína es rápida, de 1 a 2 horas se puede expresar la proteína objetivo, y de 8 a 24 horas se puede lograr el máximo.Una gran cantidad.

2. la expresión de proteínas es alta y el Gao máximo puede alcanzar más de 3 mg / ml de proteínas.

3. la respuesta es simple y flexible, solo necesita agregar una plantilla de ADN o ARN al sistema de respuesta, puedeusar96 placas de agujero o tubos centrífuga reaccionan.

Nota: este producto puede expresar proteínas convencionales y es más adecuado para expresar proteínas que contienen enlaces disulfidos.

Ámbito de aplicación

El producto Jin se limita a la investigación científica de profesionales, no se puede utilizar para diagnóstico clínico o tratamiento, ni para alimentos o medicamentos.

Instrucciones de operación

1. Construcción genética

La construcción del gen objetivo es crucial para la expresión de la proteína y se recomienda utilizar el método de construcción de la siguiente imagen. El Gen objetivo se puede construir en el plasmídeo positivo que viene con este kit (el mapa del plasmídeo se detalla en la etiqueta del embalaje exterior para escanear el archivo dentro del Código qr), es decir, la siguiente forma de construcción; También es compatible con los plásmidos de la serie PET que contienen promotores t7, como pet9a y Piet - 23a, pero no lactosa operon (lac).

Nota: los plásmidos que contienen Operón de lactosa Lac (como pet28a, etc.) pueden tener un mayor impacto en la producción y no se recomienda su uso directo.

El diagrama esquemático de la secuencia de ADN del Plásmido positivo se muestra de la siguiente manera.:

2. Preparación de plantillas

Los kits de síntesis de proteínas acelulares pueden usar ADN o arnm como plantilla para expresar proteínas recombinantes. La plantilla de ADN utilizada puede ser un plasmídeo, un producto PCR o un producto de amplificación de anillo rodante RCA con phi29.

2.1 plasmídeos: sintetizar a través de una empresa genética o subclonar para obtener un plasmídeo adecuado para reacciones sin células, y extraer el plasmídeo mediante purificación de columnas;

2.2 productos PCR: diseñar el primer, el primer positivo es de unos 200 BP aguas arriba del promotor t7, y el primer inverso es de unos 200 BP aguas abajo del Código de terminación (incluido El Terminator t7), amplificando la plantilla, y el fragmento lineal de ADN obtenido se puede poner directamente en el sistema de respuesta acelular sin purificación. La base de 200 BP aguas arriba y aguas abajo actúa para proteger los fragmentos lineales de ADN de la degradación de las enzimas exógenas endógenas.

2.3 productos RCA: amplificación de RCA por anillo rodante con polimerasa phi29 y seis primeros aleatorios, los productos de ADN obtenidos se pueden utilizar directamente en sistemas de reacción acelulares.

2.4 PCR y RCA se pueden combinar con Golden Gate y Gibson assembly, lo que aumentará en gran medida la velocidad y el flujo de preparación de plantillas de adn.

2.5Las plantillas de ADN deben ser precisas y cuantitativas antes de su uso; Se recomienda utilizar kits de extracción de plasmídeos de alta calidad para la extracción de plasmídeos y evitar la introducción de rnase a; Los plásmidos devueltos por las empresas de síntesis genética deben enfatizar el uso de métodos de purificación de columnas, de lo contrario no se pueden usar directamente para reacciones sin células.

3. Expresión de proteínas acelulares

3.1El líquido a y el líquido B necesarios para calcular la cantidad total del sistema de reacción (relación de volumen 1: 2), añadir el reactivo utilizado al hielo al recipiente de reacción (por ejemplo, 2 ml de tubo centrífuga de fondo redondo) y mezclar bien. El proceso de operación requiere Usar guantes y máscaras durante todo el proceso, y usar una cabeza de succión de pipeta sin fuente enzimática y un recipiente de reacción para evitar la introducción de nucleasa.

El sistema de reacción acellular se puede mezclar y preparar con referencia a la siguiente tabla:

3.2Añadir ADN de plantilla al sistema de reacción, la concentración final recomendada de adición de plantilla de ADN es de 5 a 10 μg / ml, lo que puede optimizar la cantidad de adición de plantilla de adn.

3.3Coloque el recipiente de reacción en un agitador ordinario o en un masonero de temperatura constante para la expresión de proteínas acelulares, y la temperatura de reacción recomendada es de 25 a 30 grados celsius. Reducir la temperatura reduce la tasa de síntesis de la proteína, pero aumenta la solubilidad de la proteína. En general, la reacción puede alcanzar la producción máxima de proteína da en aproximadamente 8 horas, o puede pasar la noche reaccionando en 16 horas. cuando la temperatura de reacción disminuye, el tiempo de reacción debe aumentarse adecuadamente.

3.4La expresión de proteínas acelulares requiere suficiente oxígeno y el sistema de reacción no supera los 100 μl cuando se utiliza un tubo centrífuga de fondo redondo de 2 ML como recipiente de reacción. Las reacciones proteicas acelulares se pueden ampliar en proporciones iguales, y el sistema de reacción amplificado necesita usar un recipiente de reacción más grande, como una botella oscilante, etc., al tiempo que garantiza la velocidad de rotación de la mecedora (200 rpm).

4. pruebas

Al final de la reacción, se toma el líquido de reacción (para detectar todas las proteínas) o el sobrenadante de reacción (para detectar las proteínas solubles) en aproximadamente 1 μl para la expresión de la proteína objetivo por SDS - page.

5. control positivo

En este Kit hay un plasmídeo de proteína fluorescente verde SF - GFP como control positivo, que puede observar directamente los resultados de la reacción a simple vista. Después de la expresión exitosa de SF - gfp, el sistema de respuesta acelular mostrará un verde obvio.

Para la cuantificación precisa de SF - gfp, se puede utilizar un medidor de enzima para la detección (ex / EM = 485 / 528 nm).