Kit de ensayo CHIP (magnético)

Número de artículo:CH1581/CF1581/CM1581/CG1581

Condiciones de almacenamiento:Conservación a 4ºC

Descripción del producto

Los kits de detección de chip se utilizan para precipitar fragmentos de cromatina que se unen a la proteína objetivo a través de la inmunoprecipitación, y finalmente para detectar fragmentos de cromatina precipitados a través de métodos como PCR o southern. Generalmente se utiliza para detectar si proteínas de Unión al ADN genómico como factores de transcripción específicos o histonas están en el mismo complejo que las secuencias de ADN genómico específicas esperadas. A través de la detección de chip se pueden obtener conclusiones sobre si la proteína objetivo in vivo y el fragmento de ADN del genoma esperado están en el mismo complejo. Los resultados de la prueba de chip, por su parte, aclaran que esta unión ocurre realmente dentro de la célula.

BenEl kit de detección de chip utiliza ha / dykddk / myc / GFP - nanoab - gigantes beads como cuentas desplegables de chip, que tienen las características de alta carga, fuerte fuerza de unión, ahorro de tiempo y alta eficiencia. El kit proporciona Primers controlados premezclados (controlprimers), que se pueden utilizar para amplificar parte de la secuencia correspondiente de la gapdh humana. la secuencia de Primers es: 5 '- tactagcgttachtagcggcg - 3'; 5’-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3’。

Pasos de operación (solo para referencia):

I. optimización de las condiciones de tratamiento ultrasónico de las muestras:

1. prepare una cantidad adecuada de PBS preconfriados y 100mm pmsf. Disuelva completamente el SDS lysis Buffer en un baño caliente adecuado y mezcle bien.

2. Cultivo celular en una placa de Petri celular 250px con una dosis de 10 ML. añadir una cantidad adecuada de formaldehído directamente al cultivo celular en el momento en que se espera que se produzca la Unión de la proteína objetivo y el ADN genómico, mezclar suavemente hasta una concentración final del 1%. A continuación, se incuba a 37ºc durante 10 minutos para entrelazar la proteína objetivo y el ADN genómico correspondiente. Ejemplo: cuando se agregan 10 ml de medio de cultivo celular a la placa de Petri celular 250px, se debe agregar 270ul 37% de formaldehído. Preste atención al uso de formaldehído de alta calidad y durante el período de uso efectivo en la medida de lo posible. Las células también se pueden cultivar en una placa de Petri de células 150px, y la dosis de la solución en cuestión debe ajustarse proporcionalmente.

3. agregue 1,1 ml de Glycine Solution (10x) y mezcle suavemente. Deje a temperatura ambiente durante 5 minutos.

4. coloque la placa de petri con muestras celulares en un baño de Hielo. Inhiba el medio de cultivo que contiene formaldehído y Glicina y trate de mantenerse libre de residuos líquidos.

5. dejar a temperatura ambiente durante 5 minutos, durante el cual diluir 100 mm pmsf a 1 mm con PBS preconfriados, es decir, preparar PBS preconfriados con baño de hielo que contengan 1 mm pmsf. La solución acuática pmsf debe prepararse fresca, y su vida media en fase acuática es de unos 30 minutos.

6. agregue 5 - 10 ml de PBS preconfriado (incluido 1 mm pmsf), lave las células, absorba el líquido y trate de mantenerse libre de residuos líquidos.

7. agregue 5 - 10 ml de PBS preconfriado (incluido 1 mm pmsf) para lavar aún más las células, absorber el líquido y tratar de mantener sin residuos líquidos.

8. añadir 1 ml de PBS preconfriado (incluido 1 mm pmsf), raspar las células con un raspador celular y recogerlas en un tubo centrífuga. Si la célula se puede derribar con una pistola, también se puede soplar con una pistola. Las células se cuentan y se dividen en aproximadamente un millón de células por tubo.

9. 4 ° c, 800 - 1000g centrifugado durante 1 - 2 minutos, precipitando completamente las células. Si se encuentra una precipitación insuficiente, el tiempo de centrifugación se puede prolongar adecuadamente. Absorbe el líquido superior y minimiza los residuos líquidos.

10. preparar una cantidad adecuada de SDS lysis Buffer que contiene pmsf de 1 mm. El millón de células en el paso anterior se precipitaron con 0,2 ml de SDS lysis Buffer que contenía 1 mm pmsf.

11. incubar en un baño de hielo durante 10 minutos para romper completamente las células.

12. procesamiento por ultrasonido para cortar el ADN genómico, rompiendo la mayor parte del ADN en un tamaño de 200 - 1000 bp, es mejor controlar la mayor parte de los fragmentos en 400 - 800 bp. Durante la ecografía, se debe tener cuidado de mantener la muestra en un baño de hielo y mantener una temperatura baja. El efecto del Corte por ultrasonido se puede detectar con la electrografía convencional en gel de agarosa de ADN después de la eliminación posterior del entrecruzamiento. Las condiciones para el tratamiento por ultrasonido se pueden establecer generalmente en 10 segundos cada vez, un total de 3 - 4 veces, y en 50 W se establecen en el 30% de la Potencia máxima, utilizando una cabeza de ultrasonido de 2 mm.

La configuración de los diferentes instrumentos de tratamiento ultrasónico no es la misma. al explorar las condiciones de ultrasonido, primero se pueden fijar otras condiciones, primero se puede determinar cuánto tiempo cada ultrasonido no causará fiebre obvia, y luego se pueden explorar diferentes números de ultrasonido. Hasta que se encuentre un número de ultrasonido más adecuado, se puede hacer la mayor parte del genoma.El ADN se rompió en un tamaño de 200 - 1000 bp. Hay que tener en cuenta que el volumen y la cantidad de células de cada ultrasonido deben fijarse, de lo contrario no se puede utilizar una condición de ultrasonido relativamente fija para experimentos posteriores.

Nota: en el genoma post - ultrasonidoCuando se detecta el tamaño del adn, si se utiliza el método de Tinción de gel de agarosa (es decir, la forma en que se agregan los tintes de ácido nucleico al amortiguador de carga) o el método de Tinción de pegamento, debido a que el SDS se une a este tipo de tintes durante la electrorregulación para formar bandas anormales, generalmente alrededor de 500 - 1000 bp, lo que tendrá un cierto impacto en el juicio del tamaño del ADN genómico después de la ecografía. Se recomienda utilizar el método de post - teñido para detectar el tamaño de la banda. el uso de este método no tendrá bandas anormales, no afectará el juicio del tamaño del ADN genómico después de la ecografía, y el tamaño de la banda es más preciso.

13. añadir 8ul 5m NaCl a 0,2 ml de muestra tratada por ultrasonido y mezclar bien. 65 ° C se calienta durante 4 horas para eliminar el enlace cruzado entre la proteína y el ADN del genoma.

14. añadir el equilibrio tris de volumen igualBencenofeno，Vortex se mezcla violentamente y luego se centrifuga a unos 4 ° C y 12000 G durante 5 minutos. Absorbe el líquido superior en otro tubo centrífuga.

15. añadir cloroformo de igual volumen, vortex se mezcla violentamente, seguido de 4ºc, centrifugación de unos 12000 G durante 5 minutos. Absorbe el líquido superior en otro tubo centrífuga.

Nota:La extracción de cloroformo de fenoles de los pasos 14 y 15 anteriores se puede operar con un kit de purificación de adn.

16. tomar una pequeña cantidad de líquido obtenido a través de la extracción de cloroformo de fenoles o el kit de purificación de adn, para el producto de extracción de cloroformo de fenoles, se puede tomar 5 - 10 ul, para el producto de purificación del kit de purificación de adn, se puede tomar 2 - 5 ul, se puede realizar gel de agarosa y observar el efecto de corte del tratamiento ultrasónico en el ADN genómico.

2. Inmunoprecipitación de cromatina:

1. después de optimizar las condiciones de procesamiento ultrasónico de la muestra, se seguirán lasOptimización de las condiciones de tratamiento por ultrasonido de las muestrascentro1 - 11Los pasos se operan y se refieren a los pasos12 se sometió a tratamiento ultrasónico.

2. para las muestras tratadas por ultrasonido a 4ºc, 12000 - 14000 G centrifugadoras durante 5 min. Retire el líquido superior (unos 0,2 ml) en un tubo centrífuga de 2 ML y póngalo en un baño de Hielo.

3. prepare una cantidad adecuada de Chup Dilution Buffer que contiene pmsf de 1 mm. Añadir 1,8 ml de chip Dilution Buffer que contiene 1 mm pmsf para diluir la muestra tratada por ultrasonido, de modo que el volumen final sea de 2 ML.

4. retire la muestra de 20ul como entrada para pruebas posteriores. Tomar20ul HA/DYKDDDDK/Myc/GFP-Nanoab-perlas magnéticasañadirLa solución PBS o tbst se limpia por soplado a 500ul, se coloca en un soporte magnético y se lava cuidadosamente el líquido superior con un pipeta, y se limpia 2 - 3 veces seguidas (para reducir mejor la inespecífica 1, también se puede pretratar beds con BSA al 1 - 5% o leche desnatada durante 1 hora).

5. se limpiará o cerrará20ul HA/DYKDDDDK/Myc/GFP-Nanoab-perlas magnéticasPasos de adhesión3 de las muestras restantes, se puede utilizar simultáneamente una solución de muestra libre de células como control en blanco, así como una muestra sin beads como control negativo, o un anticuerpo no relacionado como control negativo. Girar lentamente o balancearse a 4ºC y mezclar durante 30 - 60 minutos para precipitar la proteína objetivo o el complejo correspondiente.

6. coloque el tubo centrífuga anterior que contiene la muestra en el soporte magnético durante 10 S. retire el sobrenadante con mucho cuidado y no toque la precipitación. Posteriormente, se lava la precipitación con la siguiente solución a su vez, con una cantidad de 1 ml por lavado, 3 - 5 min girando lentamente o balanceándose a 4ºC cada vez, y luego se coloca en un soporte magnético durante 10 S. retire cuidadosamente el líquido de limpieza superior y no toque la precipitación.

(a) bajo sal Immune comprex WASH Buffer se lava una vez.

(b) High Salt Immune comprex WASH Buffer se lava una vez.

(c) Lich Immune comprex WASH Buffer se lava una vez.

(d) te Buffer se lava dos veces.

Nota:La precipitación obtenida después de completar todos los pasos de lavado anteriores se puede utilizar para amplificar la secuencia genética objetivo por PCR o para detectar la secuencia genética objetivo con southern, o para la detección de western, etc.

En tercer lugar,Secuencia genética objetivo amplificada por PCR (por ejemplo, los productos chip se utilizan para detectar la secuencia genética objetivo):

1. preparar una cantidad adecuada de amortiguador de elusión (1% sds, 0,1m nahco3) en estado fresco.

2. completar los pasosPasos de Inmunoprecipitación第7Después de los pasos, es decir, después de completar todos los pasos de lavado, añadir250ul Elution buffer。 Vortex se mezcla bien, gira o se balancea a temperatura ambiente para continuar eluyendo durante 3 - 5 minutos.

3. coloque la separación en el soporte magnético durante 10 segundos y transfiera el líquido superior a un nuevo tubo centrífuga. Se agrega 250ul eleution Buffer a la precipitación. Vortex se mezcla bien, gira o se balancea a temperatura ambiente para continuar eluyendo durante 3 - 5 minutos.

4. coloque en el soporte magnético para separarlo durante 10 segundos y retire el líquido superior. Y la fusión de shangqing obtenida en el paso 3 del paso anterior. Un total de aproximadamente 500ul shangqing.

5. agregue 20ul 5m NaCl a 500ul shangqing y mezcle bien. 65 ° C se calienta durante 4 horas para eliminar el enlace cruzado entre la proteína y el ADN del genoma. Para la muestra de 20ul obtenida en el paso 2d como entrada, se añade 1ul 5m nacl, se mezcla bien y se calienta a 65ºc durante 4 horas, lo que también se utiliza para eliminar el enlace cruzado entre la proteína y el ADN genómico. Después de completar este paso, se pueden continuar los pasos posteriores, o primero se puede congelar a - 20ºc, y los pasos posteriores se pueden continuar al día siguiente.

Nota1: las muestras en este momento ya están disponibles paraPCR， Se puede intentar utilizar muestras de 1, 2, 5 o 10 ul como plantilla para la detección de genes con fines pcr. En este momento, el efecto de la PCR está relacionado con la cantidad de ADN que puede precipitarse y si todo el sistema de amplificación de PCR es fácil de expandir el gen objetivo. Si se descubre que el efecto de la PCR no es bueno, se puede considerar purificar y concentrar la muestra a través de pasos de purificación posteriores antes de realizar la prueba pcr.

Nota2: normalmente, se recomienda realizar una purificación posterior antes de hacerloPara la detección pcr, la entrada generalmente no requiere pasos de purificación posteriores.

6. añadir 10 ul 0,5 m edta, 20 ul 1m tris pH 6,5 y 1ul 20 mg / ml de proteasa k a una muestra de aproximadamente 520ul. mezclar e incubar a 45ºC durante 60 minutos.

7. añadir el equilibrio tris de igual volumenBencenofeno，Vortex se mezcla violentamente y luego se centrifuga a unos 4 ° C y 12000 G durante 5 minutos. Absorbe el líquido superior en otro tubo centrífuga.

8. añadir un volumen igual de cloroformo, vortex se mezcla violentamente y luego se centrifuga a unos 4 ° C y 12000 G durante 5 minutos. Absorbe el líquido superior en otro tubo centrífuga.

9. añadir 20ug glycogen o Yeast trna, añadir 1 / 10 volumen de 3M naac, ph5.2, y luego añadir 2,5 veces el volumen de etanol anhidro. Después de mezclar, la precipitación de - 70ºC no es inferior a 1 hora, o la precipitación de - 20ºC es superior a 8 horas.

10. centrifugar a 4 ° c, 12000 - 14000 G durante 10 minutos, aspirar cuidadosamente la mayor parte del sobrenadante y no tocar la precipitación.

11. añadir alrededor de 1 ml de etanol al 70% para lavar y precipitar. Centrifugar a 4ºc, 12000 - 14000 G durante 10 minutos, aspirar cuidadosamente la mayor parte del sobrenadante y no tocar la precipitación.

12. 4 ° c, 12000 - 14000 G centrifugación durante 1 min, absorba cuidadosamente el líquido residual.

13. precipitación de ADN en suspensión pesada con una pequeña cantidad de te o agua para la detección PCR del gen objetivo. Es mejor diseñar dos grupos de Primers para pcr, que pueden usar la entrada como plantilla para explorar las condiciones PCR correspondientes de antemano, y seleccionar un grupo de Primers con mejores resultados para la detección final de pcr. En unos pocos casos, cuando la banda PCR es demasiado débil, se pueden realizar dos rondas de amplificación utilizando la tecnología PCR nested.

Nota: pasosLos pasos 7 a 13 también pueden purificar el ADN con un kit de purificación de ADN adecuado.

4,Western detecta productos chip (si los productos chip se utilizan para la detección de western):

1. pasos a seguirInmunoprecipitación de cromatina第En 8 pasos, después de completar todos los pasos de lavado, agregue 25 ul de tampón de muestra de proteína SDS - page (1x). El tampón de muestra superior de proteína SDS - page (1x) se puede diluir con agua con el tampón de muestra superior de proteína SDS - page (5x). El baño de agua hirviendo se hierve durante 10 minutos.

2. tome 10 - 20ul para la prueba de western.

Precauciones:

1. es necesario traer su propia resistencia para chip, 37% formaldehído, PBS，PMSF，Elutioin (1% SDS, 0.1M NaHCO3)， Proteasa k, glycogen o arnt, equilibrio trisBencenofeno, cloroformo,Etanol 95%, etanol 70%, 3M naac (ph5.2) y soporte magnético, raspador celular o pala celular.

2. es necesario traer su propio procesador de muestras de ultrasonido (sonicator), también conocido como trituradora de ultrasonido o trituradora de células de ultrasonido.

3. al usar formaldehído, operar en el Gabinete de ventilación.

4. este producto se limita a la investigación científica de profesionales, no se puede utilizar para diagnóstico clínico o tratamiento, no se puede utilizar para alimentos o medicamentos, y no se puede almacenar en viviendas ordinarias.

6. para su seguridad y salud, Use ropa experimental y guantes desechables.