Respuesta de la nueva marca de línea - determinación de alfa - lactoproteína y beta - lactoglobulina en la leche de vaca y sus productos NY / t 4630

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Respuesta de la nueva marca de línea - determinación de alfa - lactoproteína y beta - lactoglobulina en la leche de vaca y sus productos NY / t 4630 - 2025

Fecha:2025-05-27Leer:0

Introducción

La leche cruda es rica en una variedad de proteínas activas naturales, como alfa - lactoproteína (alfa - lactalbumin), beta - lactoglobulina (beta - lacteoglobulina), Lactoferrina (lactoferin, lf), inmunoglobulina g (immunoglobulin g, igg) y Lactasa (lacoperoxidase, lp), que juegan un papel importante en la resistencia a la invasión bacteriana y viral, mejorando la inmunidad y promoviendo la reparación de tejidos y el crecimiento y desarrollo. Entre ellos, la alfa - lactoproteína tiene efectos anticancerígenos, antibacterianos y antivirales, regula la función inmune y promueve la síntesis de lactosa y la secreción de leche; La beta - lactoglobulina tiene actividades reductoras de colesterol, antioxidantes y antivirales, promoviendo la digestión y absorción de vitaminas liposolubles. Diferentes métodos de tratamiento térmico (pasteurización, esterilización a alta temperatura (uht), concentración por evaporación y secado por pulverización, etc.) pueden causar diferentes grados de desnaturalización y inactivación de alfa - lactoproteína y beta - lactoglobulina en los productos lácteos, afectando así su valor nutricional y su precio de mercado.

Aspectos destacados del nuevo plan de respuesta de saimerfei

1.Este ensayo se refiere a NY / t 4630 - 2025 y las normas grupales y empresariales pertinentes para determinar el contenido de alfa - lactoproteína y beta - lactoglobulina en leche pasteurizada, leche esterilizada a temperatura ultra alta y leche de fórmula infantil.NY / t 4630 - 2025 se implementará oficialmente el 1 de mayo de 2025.

2. En este ensayo se utilizó una columna de columna de ácido C4 150 de partículas de núcleo sólido con un tamaño de partícula de 2,6 micras, con un caudal más bajo..0,8 ml/min), volumen de inyección más pequeño..10 μL) y mayor frecuencia de muestreo..10 Hz), lo que hace que la forma pico y la separación de alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina se deban a los estándares.

3. Para obtener una buena forma de pico y separación, el experimento optimizó adecuadamente las condiciones de pretratamiento de la muestra y cromatografía líquida, con una temperatura de columna de 60 ° C y un caudal de 0,8 ml / min, eluyendo gradiente con un 0,1% de agua de ácido trifluoroacético - 0,1% de ácido trifluoroacético y nitrilo como fase móvil, y la presión máxima del sistema no superó.110 bar.

4. Los resultados de la prueba muestran que la alfa - lactoproteína y la beta - lactoglobulina tienen una buena forma de pico, una excelente eficiencia de columna y una excelente separación, de los cualesEl grado de separación entre el pico principal de alfa - lactoproteína y el pico de interferencia cercano es significativamente mejor que el mapa espectral estándar.. solución estándar mixta de alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina (100 μg / ml), tiempo de retención de alfa - lactoglobulina 21.900 min, factor de asimetría 0,98, número teórico de placas de Torre 321.137; El tiempo de retención de la beta - lactoglobulina B fue de 24.747 minutos, el factor de asimetría fue de 1,01 y el número teórico de placas de torre fue de 352.451; El tiempo de retención de beta - lactoglobulina a fue de 25467 minutos, el factor de asimetría fue de 1,00 y el número teórico de placas fue de 373359; El grado de separación entre alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina B es de 17,77, y el grado de separación entre beta - lactoglobulina B y beta - lactoglobulina a es de 4,33; Cuatro inyecciones consecutivas, el tiempo de retención y el área pico RSD son inferiores al 0,3%, y la reproducibilidad del método es buena; Rango lineal de la solución estándar de alfa - lactoproteína 0,00 - 200 μg / ml, coeficiente de correlación lineal R²≥ 099997, rango lineal de la solución estándar de beta - lactoglobulina 0,00 - 200 μg / ml, coeficiente de correlación lineal R²≥ 09991, buena línea.

5. En el ensayo para determinar el contenido de alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina en los productos lácteos mediante Cromatografía líquida de fase inversa,Accucore 150 C4La columna cromatográfica, combinada con el sistema de Cromatografía líquida de alto rendimiento Vanquish core, muestra una buena reproducibilidad y excelente estabilidad, y los límites de detección y cuantificación del método cumplen con los requisitos estándar, que pueden ser utilizados como referencia para las empresas lácteas y los laboratorios de pruebas de alimentos.

6.Con referencia a la literatura relevante, en el ensayo de determinación del contenido de alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina en productos lácteos por cromatografía de penetración en gel, se utilizaron dos en serie.MAbPac SEC-1 (300 Å, 5 μm, 7,8 x 300 mm)La columna de exclusión de volumen, con 6 m de clorhidrato de guanidina como fase móvil para la elución equigrado, puede separar eficazmente la alfa - lactoproteína y la beta - lactoglobulina a 280 nm.

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Nueva York / T 4630-2025

Solución de aplicación completa de semerfei

Preprocesamiento de muestras

1.1 muestra líquida: leche a baja temperatura (leche cruda, leche esterilizada pasteurizada) / leche a temperatura ambiente (leche esterilizada a alta temperatura (uht)

Pesar la muestra 5 g (exactamente 0,1 mg) en un tubo centrífuga de tapa giratoria graduado de 50 ml, añadir una cantidad adecuada de vórtice de agua y mezclar uniformemente durante 30 segundos, ajustar el pH a 4,60 ± 0,05 con una cantidad adecuada de ácido acético, fijar la capacidad en agua a 25,0 ml, mezclar bien el vórtice durante 1 minuto, Dejar reposar Durante más de 30 minutos y centrifugar a 12000 RPM 4 ° C durante 15 minutos. Retire el líquido claro (se puede diluir con agua ultrapura según corresponda), pase por la membrana filtrante microporosa de PTFE hidrofílica de 0,2 micras (p / n: 42213 - npl), y el filtrado se pondrá a prueba en la máquina.

1.2 muestra sólida: leche en polvo (leche de fórmula infantil)

Pesar la muestra 2 g (precisa a 0,1 mg) en un tubo centrífuga de tapa giratoria graduado de 50 ml, añadir una cantidad adecuada de mezcla de vórtice de agua durante 1 minuto para disolverla completamente (si es necesario, se puede hervir en baño de agua tibia), ajustar el pH a 4,60 ± 0,05 con una cantidad adecuada de ácido acético, fijar el volumen de agua a 25,0 ml, mezclar el vórtice durante 1 minuto, Dejar reposar durante más de 30 minutos y centrifugar a 12000 RPM a 4 ° C durante 15 minutos. Retire el líquido claro (se puede diluir con agua ultrapura según corresponda), pase por la membrana filtrante microporosa de PTFE hidrofílica de 0,2 micras (p / n: 42213 - npl), y el filtrado se pondrá a prueba en la máquina.

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Configuración del instrumento y condiciones cromatográficas

Thermo Scientific ™ Vanquish Core ™ Sistema de Cromatografía líquida de alto rendimiento, configuración: bomba quarternery Pump c (vc - P20 - a), muestreador automático Split sampler CT (vc - A12 - a), caja de temperatura de columna columna columna columna compartment c (vc - C10 - a), detector de matriz Diode CG (vc - D11 - a), procesamiento de datos chromelon ™ 7,3

Columna: acucore 150 c4, 2,6 μm, 4,6 × 150 mm (p / n: 16526 - 154630)

Fase móvil: a: 0,1% agua de ácido trifluoroacético b: 0,1% nitrilo de ácido trifluoroacético

Velocidad de flujo:0.8ml / min

Procedimiento de elución de gradiente:

Cantidad de muestra:10µL

Temperatura de la columna: 60 ℃.

Detector: dad, longitud de onda de adquisición: 210 nm; frecuencia de adquisición:10Hz; adquisición espectral: 190 - 400 nm

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Mapas espectrales y datos

Espectro de separación y datos de la solución estándar mixta de 3,1 alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina

Figura 1 espectro de separación y datos de la solución estándar mixta de alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina (100 μg / ml)(haga clic para ver la imagen grande)

Como se muestra en la figura 1, la alfa - lactoglobulina y la beta - lactoglobulina tienen una buena forma de pico, una excelente eficiencia de columna y una mejor separación que el estándar. El tiempo de retención de alfa - lactoproteína fue de 21.900 min, el factor de asimetría fue de 0,98 y el número teórico de placas de torre fue de 321.137; El tiempo de retención de la beta - lactoglobulina B fue de 24.747 minutos, el factor de asimetría fue de 1,01 y el número teórico de placas de torre fue de 352.451; El tiempo de retención de beta - lactoglobulina a fue de 25.467 minutos, el factor de asimetría fue de 1,00 y el número teórico de placas de torre fue de 373.359. El grado de separación de alfa - lactoglobulina B y beta - lactoglobulina B es de 17,77, y el grado de separación de beta - lactoglobulina B y beta - lactoglobulina a es de 4,33.

3.2 espectro de superposición de localización de soluciones estándar únicas de alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina

Figura 2 Mapa espectral de superposición de posicionamiento de solución estándar única de alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina (haga clic para ver la imagen grande)

La alfa - lactoglobulina y la beta - lactoglobulina se localizan en un solo estándar, como se muestra en la figura 2, y la alfa - lactoglobulina, la beta - lactoglobulina B y la beta - lactoglobulina a tienen absorción característica a 200 y 279 nm.

3.3 espectro de superposición de muestras continuas de solución estándar mixta de alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina

Figura 3 espectro de superposición de muestras continuas de solución estándar mixta de alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina (100 μg / ml, n = 4) (haga clic para ver la imagen grande)

La solución estándar mixta de alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina (100 μg / ml) se inyectó cuatro veces seguidas, con un RSD inferior al 0,3% en el tiempo de retención y el área pico, con buena reproducibilidad del método, y el espectro de separación y los datos se detallan en la figura 3.

Espectro de superposición de la curva de calibración de la solución estándar de 3,4 alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina

Figura 4 espectro de superposición de curvas de calibración de soluciones estándar de alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina (0.00 / 40.0 / 80.0 / 120 / 160 / 200 μg / ml) (haga clic para ver la imagen grande)

Los niveles de alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina suelen ser altos en la leche cruda y pasteurizada, por lo que se seleccionaron los rangos lineales recomendados por los estándares de grupo T / tdstia 002 - 2021 y T / tdstia 007 - 2019. Como se muestra en la figura 4, el rango lineal de la solución estándar de alfa - lactoproteína es de 0,00 - 200 μg / ml, y el coeficiente de correlación lineal R²≥ 099997, rango lineal de la solución estándar de beta - lactoglobulina 0,00 - 200 μg / ml, coeficiente de correlación lineal R²≥ 09991, buena línea. Entre ellos, la beta - lactoglobulina B y la beta - lactoglobulina a se cuantifican en grupos compuestos.

3,5 soluciones estándar de alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina (40,0 μg / ml) superpuestas a soluciones en blanco

Figura 5 espectro de superposición de soluciones estándar de alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina (40,0 μg / ml) con soluciones en blanco (haga clic para ver la imagen grande)

Cuando el volumen de la muestra fue de 10 ul, la altura del pico de alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina (40,0 μg / ml) fue s, y la media del ruido de la matriz de 22,5 - 24,0 minutos fue n, y la relación señal - ruido de alfa - lactoglobulina, beta - lactoglobulina B y beta - lactoglobulina a fue de 523,3, 139,9 y 133,6, respectivamente, como se muestra en la figura 5. Por lo tanto, con la optimización del volumen de inyección, la sensibilidad del método de determinación de alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina también puede cumplir con los requisitos de 1,00 μg / ML en NY / t 4630 - 2025.

Mapa espectral de superposición de la solución estándar mixta de 3,6 alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina con la solución de muestra de leche pasteurizada

Figura 6 espectro de superposición de la solución estándar mixta de alfa - lactoproteína y beta - lactoglobulina con la solución de muestra de leche pasteurizada (haga clic para ver la imagen grande)

Además de la proteína de suero de leche, la leche de vaca contiene grandes cantidades de caseína y otras proteínas que pueden interferir en la determinación de alfa - lactoproteína y beta - lactoglobulina. Después de ajustar el ph, la centrifugación de alta velocidad y otras operaciones de pretratamiento de las muestras de leche pasteurizada, la alfa - lactoproteína y la beta - lactoglobulina no desnaturalizadas se conservan en el suero superior, y su separación conserva un mejor tipo de pico, una línea de base estable y sin interferencia al salir del pico, como se muestra en la Figura 6. La cantidad fue cuantificada por el método estándar externo, con un contenido de alfa - lactoproteína de 1.033,6 mg / kg y beta - lactoglobulina de 2.949,0 mg / kg en muestras de leche pasteurizada, que básicamente coincidía con el valor de la etiqueta.

3.7 espectro y datos de separación de muestras de leche esterilizada pasteurizada (leche a baja temperatura), leche esterilizada a alta temperatura (leche a temperatura constante) y leche de fórmula infantil

Figura 7 mapa y datos del espectro de separación de la solución de la muestra de leche pasteurizada (leche a baja temperatura)

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Figura 8 mapa y datos del espectro de separación de la solución de la muestra de leche esterilizada a temperatura ultra alta (leche a temperatura constante)

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Figura 9 espectro y datos de separación de soluciones de muestras de leche de fórmula infantil

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La alfa - lactoglobulina y la beta - lactoglobulina son más sensibles a la temperatura y las altas temperaturas pueden destruir su estructura química y actividad biológica. Como se muestra en la figura 7 - 9, no hay picos de interferencia obvios cerca de los picos objetivo de alfa - lactoproteína y beta - lactoglobulina en la leche pasteurizada (leche a baja temperatura), que son precisos, seguros y cuantitativos, y muestras como la leche cruda y la leche pasteurizada son adecuadas para el primer método NY / t 4630 - 2025; Por su parte, hay picos de interferencia obvios cerca del pico objetivo de beta - lactoglobulina en la leche esterilizada a temperatura ultra alta (leche de temperatura constante) y la leche de fórmula infantil, lo que afectará seriamente los resultados cualitativos y cuantitativos, la alfa - lactoproteína se ve relativamente menos afectada, la leche esterilizada a temperatura ultra alta, la leche de fórmula infantil y otras muestras no son adecuadas para el primer método NY / t 4630 - 2025, se recomienda el segundo método.

3.8 cromatografía de penetración en gel de solución estándar de alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina (segundo método)

Figura 10 cromatógrafo de penetración en gel de alfa - lactoglobulina y solución estándar de beta - lactoglobulina (500 mg / l) (haga clic para ver la imagen grande)

Con referencia al artículo publicado por el profesor Du ruyun en la revista China Dairy industry, "determinación del contenido de alfa - lactoglobulina en leche, leche en polvo y suero en polvo por cromatografía de exclusión de volumen" (2022), se utilizaron dos columnas de exclusión de volumen mabpac sec - 1 (300, 5 micras, 7,8 × 300 mm) en serie para eluir equigrado con 6 m de clorhidrato de guanidina como fase móvil, y se pudieron separar eficazmente alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina a 280 nm (como se muestra en la figura 10), y se probaron 60 lotes de leche en polvo, leche en polvo y suero en polvo para verificar la aplicabilidad y estabilidad del método. para más detalles, consulte el espectro original.- sí.

Las especificaciones de la columna cromatográfica mabpac sec - 1 son las siguientes:7,8 × 300mm， El caudal recomendado es de 0,5 ml / min, logrando un ahorro de disolvente bajo la premisa de garantizar el grado de separación, que se puede seleccionar.4,0 × 300Columna de tamaño mm, el caudal recomendado es de 0,2 ml / MIN (se puede ajustar adecuadamente según corresponda).

Recomendación de consumibles cromatográficos relacionados NY / t 4630 - 2025

4.1 columna de análisis y columna protectora por el primer método de Cromatografía líquida de fase inversa
Accucore 150 C4, 2,6 μm, 4,6 x 150 mm	(P/N: 16526-154630)
Acucore 150 columna protectora c4, 2,6 micras, 4,0 x 10 mm, 4 PK	(P/N: 16526-014005)
Manga de columna protectora de conexión directa uniguard	(P/N: 850-00)

4.2 columna de análisis y columna protectora por cromatografía de penetración en gel de segundo método

Velocidad de flujo:0.5ml / min
保护柱： MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4,0 x 50 mm	(P/N: 074697)
分析柱： MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 7,8 x 300 mm	(P/N: 088460)
分析柱： MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 7,8 x 300 mm	(P/N: 088460)

Velocidad de flujo:0.2ml / min
保护柱： MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4,0 x 50 mm	(P/N: 074697)
分析柱： MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4,0 x 300 mm	(P/N: 074696)
分析柱： MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4,0 x 300 mm	(P/N: 074696)

4.3 preprocesamiento de muestras
Filtro de aguja de PTFE hidrofílico Titan 3, 17 mm, 0,2 micras, 200 / PK	(P/N: 42213-NPL)

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Referencias

[1] NY / t 4630 - 2025 leche de vaca y sus productos - determinación de alfa - lactoproteína y beta - lactoglobulina - método de Cromatografía líquida de alto rendimiento

[2] determinación de alfa - lactoproteína y beta - lactoglobulina en la leche en polvo de fórmula infantil T / tdstia 026 - 2022 - método de cromatografía de penetración en gel

[3] T / tdstia 002 - 2021 determinación de alfa - lactoproteína en leche y productos lácteos - método de Cromatografía líquida de alto rendimiento

[4] T / csiq 77001 - 2020 determinación del contenido de alfa - lactoproteína en productos lácteos - método de Cromatografía líquida de alto rendimiento

[5] T / tdstia 007 - 2019 determinación de la beta - lactoglobulina en leche y productos lácteos - método de Cromatografía líquida

[6] determinación de lactoferrina, alfa - lactoglobulina y beta - lactoglobulina en leche cruda T / shnx 001 - 2025 método de espectrometría de masas en tándem por Cromatografía líquida

[7] du ruyun, Wang liang, Lin yikan. Determinación del contenido de alfa - lactoproteína en leche, leche en polvo y suero de leche por cromatografía de exclusión de volumen [j] industria láctea de china, 2022,50 (04): 46 - 51.

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