1. Este ensayo se refiere a GB 5009.299-2024, NY / t 4439 - 2023 y estándares grupales y empresariales relevantes para determinar el contenido de Lactoferrina en leche pasteurizada, leche esterilizada a alta temperatura y leche de fórmula infantil.

2. Para obtener una buena forma de pico y separación, el experimento optimizó adecuadamente las condiciones de pretratamiento de la muestra y cromatografía líquida, a una temperatura de columna de 30 ° C y un caudal de 1,0 ml / min, con0,1% agua de ácido trifluoroacético - 0,1% nitrilo de ácido trifluoroacéticoComo fase móvil para la elución gradiente, la presión máxima del sistema no supera los 106 bar.

3. Los resultados de la prueba muestran que el factor de asimetría del pico cromatográfico de la solución estándar de Lactoferrina (50,0 μg / ml) es de 1,00, la forma del pico es buena, el número teórico de placas de torre es de 30.549, y la eficiencia de la columna es excelente; Después de tres inyecciones consecutivas, el RSD del tiempo de retención y el área pico es inferior al 1%, y la reproducibilidad del método es buena; La relación señal - ruido del punto bajo lineal (1,00 μg / ml) es de 8,2, y la sensibilidad del método es alta; Rango lineal 1,00 - 200 μg / ml, coeficiente de correlación lineal R²≥ 09998, buena línea.

4. En el ensayo de determinación del contenido de Lactoferrina en los productos lácteos por Cromatografía líquida de fase inversa, la columna de cromatografía biobásica 4 (tamaño de Poro 300) junto con el sistema de Cromatografía líquida de alta eficiencia Vanquish Core mostró una buena reproducibilidad y excelente estabilidad. los límites de detección y cuantificación del método cumplen con los requisitos estándar y pueden ser utilizados como referencia para las empresas lácteas y los laboratorios de pruebas alimentarias.

1.1 extracción de muestras

1.1.1Muestra líquida: leche a baja temperatura (leche cruda, leche esterilizada pasteurizada) / leche a temperatura ambiente (leche esterilizada a alta temperatura (uht)

Pesar la muestra 5 g (exactamente 0,1 mg) en un tubo centrífuga de tapa giratoria graduado de 50 ml, fijar el volumen con un amortiguador de fosfato II a 25,0 ml, extraer la oscilación del vórtice durante 3 minutos y centrifugar a 12000 RPM 4 ° C durante 15 minutos. Deje reposar a temperatura ambiente, retire la grasa flotante superior y retire el líquido claro superior para purificarlo.

1.1.2Muestra sólida: leche en polvo (leche de fórmula infantil)

Pesar la muestra 2G (precisa a 0,1 mg) en un tubo centrífuga de tapa giratoria graduado de 50 ml, añadir una cantidad adecuada de tampón de fosfato II para disolver por agitación térmica, fijar el volumen con tampón de fosfato II a 50,0 ml, extraer por agitación de vórtice durante 3 minutos, Dejar reposar durante más de 30 minutos y centrifugar a 12000 RPM 4 ° C durante 15 minutos. Deje reposar a temperatura ambiente, retire la grasa flotante superior y retire el líquido claro superior para purificarlo.

1.2 purificación de muestras

1.2.1Activación: el conector Luer en el extremo inferior de la columna de afinidad por Heparina hypersep (p / n: 60105 - 110 - b) está conectado al dispositivo de extracción en fase sólida, y el extremo superior conecta el cilindro vacío de la jeringa de 10 ml en serie a través del conector (p / n: 60104 - 259), agregando un amortiguador de fosfato II de 2 × 5 ML para activar la afinidad por Heparina y controlar la velocidad de goteo 2d / 3s;

1.2.2Muestra superior: cuando la superficie del líquido en el paso de activación se acerque a la placa de tamiz de la columna pequeña, retire con precisión 10,0 ml de la muestra anterior al cilindro vacío de la jeringa (p / n: s7510 - 10), controle la velocidad de caída 2d / 3s y abandone la salida de líquido;

1.2.3Lavado: cuando el nivel del líquido en el paso de muestra se acerque a la placa de tamiz de la columna pequeña, agregue 2 × 5 ml de tampón fosfórico II para lavar la columna pequeña, abandone el líquido de salida, retire el cilindro vacío del conector y la jeringa, y seque la columna pequeña a presión negativa durante 2 minutos;

1.2.4Elución: añadir 2 × 2,5 ml de tampón fosfórico I para eluir, recoger todo el eluido y fijar el volumen a 5,00 ML con tampón fosfórico i, pasar el filtro de aguja de PTFE hidrofílico de 0,2 micras (p / n: 42213 - npl), y el filtrado debe ser probado en la máquina.

Thermo Scientific ™ Vanquish Core ™ Sistema de Cromatografía líquida de alto rendimiento, configuración: bomba quarternery Pump c (vc - P20 - a), muestreador automático Split sampler CT (vc - A12 - a), caja de temperatura de columna columna columna columna compartment c (vc - C10 - a), detector de matriz Diode CG (vc - D11 - a), procesamiento de datos chromelon ™ 7,3

Columna: biobásico 4, 5 μm, 4,6 × 250 mm (p / n: 72305 - 254630)

Fase móvil: a: 0,1% agua de ácido trifluoroacético b: 0,1% nitrilo de ácido trifluoroacético

Caudal: 1,0 ml / min

Procedimiento de elución de gradiente:

Cantidad de muestra: 50 μl

Temperatura de la columna: 30 ℃.

Detector: dad, longitud de onda de adquisición: 280 nm; frecuencia de adquisición: 5 hz; adquisición espectral: 190 - 400 nm