Prólogo

Anticuerpos - fármacos de moléculas pequeñas acoplados (adcs), una clase de productos biológicos terapéuticos, pueden identificar con precisión las células Diana a través de anticuerpos, liberando fármacos de moléculas pequeñas acoplados después de entrar en las células Diana a través de la endocitosis, logrando así el propósito de matar con precisión a las células Diana y minimizando el daño a las células normales. Debido al principio de diseño del adc, se compara vívidamente con "misiles biológicos", desde el primer medicamento adc, mylotarg, en 2000. ® Después de que (gemtuzumab ozogamicina) fue aprobado por la FDA [1], en junio de 2025, 19 ADC habían sido aprobados para su comercialización en todo el mundo. Desde que las ventas globales de ADC superaron los 10 mil millones de dólares por primera vez en 2023, las ventas globales de ADC continuaron superando los 10 mil millones de dólares en 2024, manteniendo un fuerte impulso de crecimiento.

Entre los diez mejores ADC en ventas globales de ADC en 2024, el segundo lugar es kadcyala (emmy trastozhu, herselet) producida por roche. El medicamento fue aprobado por la FDA para su comercialización en 2013 para el tratamiento del cáncer de mama HER2 positivo, con ventas globales de unos 2.300 millones de dólares en 2024 [2]. Embetrastuzumab es un ADC dirigido a HER2 que contiene Trastuzumab humanizado anti - HER2 igg1. el anticuerpo se une covalentemente al inhibidor de microtubulos dm1 (derivado de metanfetamina) a través de un conector estable de tioéter MCC (4 - [n - maleimide - metilciclohexano - 1 - éster de ácido nucleico), con un rango de distribución de peso molecular de 147 a 158 KDA y una distribución de la relación de acoplamiento fármaco / Anticuerpo monoclonal (drug to Anti - Antibody ratio, dar) de 0 a 8, con un dar promedio de aproximadamente 3,5 [3]. Debido a la complejidad de su estructura, es bastante desafiante caracterizarla. En el estudio de este artículo, utilizamos lo que acaba de ser publicado en la Conferencia anual de espectrometría de masas de Estados Unidos (asms) de este año.Espectrómetro de masas de ultra alta resolución de nueva generación en dos en uno excedion pro BioPharmaLa caracterización completa de kadcyala demuestra la excelente capacidad analítica de la plataforma en el campo biofarmacéutico, especialmente la función de fragmentación de colisión de alta energía asistida por disociación de transferencia electrónica (ethcd), que ayuda a identificar con precisión los sitios de acoplamiento de fármacos y la identificación de modificaciones posttranslacionales (ptm).

Aspectos destacados de la aplicación

Como se mencionó anteriormente, la nueva generación de espectrómetros de masas de ultra alta resolución dos en uno de este año, excedion pro biopharma, se utilizó para la caracterización en profundidad de kadcyala. Los aspectos más destacados del instrumento incluyen, pero no se limitan a ampliar el rango de detección de masa a M / z = 12000 da (se requiere configurar la opción biopharma), que puede cumplir con la determinación de peso molecular de monómeros / dímeros / trimers de anticuerpos monoclonales en condiciones no degenerativas, así como otros Complejos proteicos de gran peso molecular; La función ETD seleccionada permite una fragmentación ETD / ethcd rápida y sensible, combinada con una fragmentación de colisión de alta energía (hcd), que puede obtener una cobertura completa y rica de la secuencia de proteínas e información de identificación de ptm. La estructura del instrumento excedion pro BioPharma se muestra en la figura 1, y la figura 2 muestra el proceso de caracterización en profundidad de kadcyala en este experimento.

Figura 1. el diagrama de estructura de excedion pro BioPharma se destaca en azul en la imagen en comparación con la parte de actualización de hardware de la generación anterior. La selección de BioPharma Edition puede ampliar el alcance de la detección de calidad a M / z = 12000 da (sección de caja verde), y la selección de ETD puede lograr la fragmentación de ETD / ethcd (sección de caja roja). (haga clic para ver la imagen grande)

Figura 2. diagrama de flujo de caracterización kadcyala.

(haga clic para ver la imagen grande)

Desliza hacia abajo para ver todo

Determinación del peso molecular completo de kadcyala en condiciones no degenerativas

La determinación del peso molecular completo es una característica esencial en la caracterización de productos biomédicos. para adc, además del peso molecular completo, el valor promedio dar y la distribución de la carga del medicamento (dld) también son atributos clave para juzgar la calidad del medicamento. En este experimento, determinamos el peso molecular completo de kadcyala en condiciones no degenerativas. Las condiciones no degenerativas utilizan un sistema de sal tampón neutral. en comparación con las condiciones degenerativas, las moléculas proteicas están más cerca de su estado natural y las proteínas están menos cargadas y los picos de espectrometría de masas entre los Estados de carga adyacentes se superponen menos. puede reducir la interferencia mutua entre las señales de espectrometría de masas y ayudar a obtener resultados más precisos de determinación de peso molecular completo. La figura 3 muestra los resultados de la determinación del peso molecular completo en condiciones no degenerativas de kadcyela. Para acercar la muestra a su Estado natural, no la eliminamos de azúcar. Como se puede ver en la figura 3a, a nivel de espectro original, los picos de espectrometría de masas acoplados a diferentes cantidades de fármacos y diferentes componentes azucarados logran básicamente la separación basal, y la distribución de acoplamiento de fármacos de 0 a 8 se puede observar claramente después de la deconvolución (figura 3b). el software BioPharma Finder puede calcular automáticamente el valor promedio de dar, que es de 3,47 (figura 3c) para este adc, en línea con el 3,5 reportado en la literatura.

(A)

b)

c)

Figura 3. resultados de la determinación del peso molecular completo de kadcyala en condiciones no degenerativas. A, Mapa espectral original y mapa local ampliado. B, Mapa espectral de deconvolución. C, el software BioPharma Finder puede seleccionar automáticamente los componentes relevantes y calcular el valor promedio del dar. (haga clic para ver la imagen grande)

Desliza hacia abajo para ver todo

La fragmentación secundaria de ethcd dependiente de datos se utiliza para el análisis de mapas de péptidos,

Lograr la localización de sitios de acoplamiento y la identificación de ptm

El análisis de mapas de péptidos basado en la combinación de líquidos y masa es uno de los métodos de análisis comunes en la caracterización de productos bioterapéuticos, que puede lograr la cobertura de la secuencia, la localización de varios sitios de modificación química y el análisis cualitativo y cuantitativo de modificaciones posttraduccionales comunes. Entre las diversas técnicas de fragmentación por espectrometría de masas, debido a que la fragmentación por hcd puede producir abundantes iones de fragmentos B / y después de romper los enlaces péptidos para la identificación de segmentos de péptidos, es ampliamente utilizada en el análisis de mapas de péptidos. Sin embargo, para algunos segmentos de péptidos modificados, como los péptidos de azúcar, los segmentos de péptidos de acoplamiento de fármacos, etc., debido a que el hcd rompe el acoplamiento de cadenas de azúcar / conectores de fármacos, el uso de la fragmentación de hcd no puede localizar con precisión los sitios de modificación para los segmentos de péptidos con múltiples sitios de modificación potenciales; Además, para algunos segmentos de péptidos que contienen aminoácidos isomerizados, como la isomerización de Leucina / isoleucina, ácido aspártico / ácido aspártico, etc., no se puede distinguir debido a la misma masa de iones B / y producidos por hcd. Por su parte, debido a los diferentes mecanismos de reacción, ETD no sólo puede conservar completamente las modificaciones de las cadenas laterales, como la cadena de azúcar y el acoplamiento de fármacos, mientras fragmenta el esqueleto del segmento de péptidos, sino también producir iones diagnósticos característicos para los aminoácidos isomerizados, logrando así la identificación y distinción de los aminoácidos isomerizados. La adición de la fragmentación asistida por hcd a la fragmentación etd, es decir, ethcd, puede obtener iones B / y y C / z simultáneamente en el mismo espectro secundario, obteniendo información más completa y rica para lograr la caracterización de los segmentos péptidos, especialmente los segmentos péptidos modificados / isomerizados. El espectrómetro de masas de ultra alta resolución exedion pro en dos en uno está equipado con la opción ETD para lograr una fragmentación rápida y sensible ETD / etchd, que puede configurar el modo de adquisición de datos ethcd secundario dependiente de datos (data dependent ethcd ms2, dd ethcd ms2) y complementarse con la fragmentación secundaria hcd dependiente de datos (dd hcd ms2) Para obtener información completa de análisis de mapas de péptidos.

En el estudio de este trabajo, utilizamos dos proteasas, TRYPSIN y aspn, respectivamente, para desnaturalizar kadcyala, y luego para las muestras de dos proteasas diferentes, se recolectaron datos de DD hcd ms2 y dd ethcd ms2 para obtener información sobre la cobertura de la secuencia, la distribución de sitios de acoplamiento y la modificación posttraduccional. Las muestras que utilizan DD HCD ms2, TRYPSIN y aspn enzimáticos pueden lograr una cobertura de secuencia del 100% de una inyección (los datos no se muestran). La figura 4 muestra el mapa de picos de base (bpc) y el mapa de cobertura de secuencias para el análisis de mapas de péptidos de muestras utilizando la enzima dd ethcd ms2, TRYPSIN y aspn, que también pueden alcanzar una cobertura de secuencia del 100% de una inyección, demostrando que la fragmentación ETD / etchd del espectrómetro de masas de ultra alta resolución exedion pro en uno es compatible con la Cromatografía líquida de flujo convencional y obtiene un mapa de segundo orden de alta calidad para el análisis de mapas de péptidos.

Figura 4. el mapa del péptido kadcyala analiza el espectro del pico base y la cobertura de la secuencia, ambos en modo de adquisición de datos dd etchd ms2. Izquierda, muestra enzimática de trypsin. Derecha, muestra de enzima aspn. Para diferentes muestras enzimáticas de proteasa, se puede lograr una cobertura de secuencia del 100% de la inyección de una sola aguja. (haga clic para ver la imagen grande)

Como se mencionó anteriormente, el fármaco de Unión kadcyela (mcc - dm1) se acopla a la lisina a través de la Unión covalente, y también se produce el acoplamiento en el extremo n del trastuzumab, por lo que para toda la molécula kadcyela hay un total de 92 sitios de acoplamiento potenciales, de los cuales 46 no se repiten (figura 5). Debido a que la lisina se acopla covalentemente y produce una obstrucción espacial, lo que conduce a la omisión de trypsin, la enzima TRYPSIN produce un segmento de péptido de acoplamiento de fármacos que contiene múltiples lisinas, mientras que la fragmentación de hcd rompe el esqueleto del segmento de péptidos y el fármaco de acoplamiento al mismo tiempo, lo que hace que el sitio de acoplamiento de fármacos no se pueda juzgar con precisión solo por el espectro secundario de hcd. Por su parte, debido a los diferentes mecanismos de fragmentación, el ethcd puede conservar el Grupo de acoplamiento del fármaco mientras fragmenta el esqueleto del segmento del péptido, y la energía de fragmentación asistida por hcd optimizada puede hacer que el segmento del péptido se fragmente más completamente, conservando al mismo tiempo el fármaco de acoplamiento completo en la mayor medida posible. La Tabla 1 muestra la fragmentación secundaria de las muestras enzimáticas de TRYPSIN con hcd y ethcd, respectivamente, y el resumen de la información obtenida sobre los sitios de acoplamiento de fármacos. de los 46 sitios de modificación potenciales, se identificaron 43 con modificaciones de fármacos existentes, lo que demuestra el uso de la fragmentación de ethcd. para los segmentos de péptidos que contienen múltiples sitios de acoplamiento potenciales, se puede localizar con precisión la posición de acoplamiento y combinarse con los resultados de hcd para obtener información completa y detallada sobre los sitios de acoplamiento.

Figura 5. todos los sitios potenciales de modificación de la molécula kadcyala, marcados en la secuencia proteica en una caja roja, totalizan 92 sitios, de los cuales 46 no se repiten.

(haga clic para ver la imagen grande)

Tabla 1. Resumen de los sitios de identificación de kadcyala

(haga clic para ver la imagen grande)

Fuente roja, sitio de acoplamiento. "+ +", el sitio de acoplamiento se puede confirmar a través de iones de fragmentos secundarios. "+", donde existe un acoplamiento en el segmento del péptido, pero no se puede confirmar la posición específica de acoplamiento a través de iones fragmentados. "-", no se identificó el acoplamiento.

Desliza hacia abajo para ver todo

Cuando se utiliza aspn para la enzima kadcyala, la cadena pesada produce un segmento péptido D que contiene tres lisinas.K(216)K(217)VEPK(221)SC， Y a través de los resultados del análisis del mapa de péptidos de las muestras enzimáticas de trypsin, se puede ver que estas tres lisinas tienen la posibilidad de ser acopladas. El fármaco, el conector MCC - dm1 de kadcyela, contiene un centro heterogéneo (figura 6, arriba a la izquierda), lo que hace que los segmentos de péptidos de acoplamiento farmacológico se eluyan en forma de picos opuestos en la cromatografía de fase inversa. Como se muestra en la figura 6, debido a la presencia de múltiples sitios de acoplamiento potenciales y centros de isomerización MCC - dm1, el segmento péptido DK(216)K(217)VEPK(221)El diagrama de flujo de iones extraídos (xic) del SC muestra varios grupos de picos opuestos. Gracias a un espectro secundario informativo generado por la fragmentación de ethcd, se puede identificar con precisión qué sitio se ha acoplado al segmento del péptido eluido en diferentes tiempos de retención (figura 6, abajo) y se puede calcular la proporción relativa de cada modificación en función del área del pico xic (figura 6, arriba a la derecha).

Figura 6. identificación de sitios de acoplamiento de segmentos de péptidos que contienen múltiples sitios de acoplamiento a través de ethcd. (haga clic para ver la imagen grande)

Para las muestras adc, además de los sitios de acoplamiento de medicamentos, las diversas modificaciones posttraduccionales relacionadas con la calidad de los medicamentos también deben caracterizarse y monitorearse. La figura 7 muestra el espectro de fragmentación secundaria basado en ethcd para el segmento péptido fnwyviso.D(283)Resultados de la identificación de la isomerización del ácido aspártico en gvevhnak. Gracias a la alta sensibilidad y precisión de alta calidad de la plataforma del instrumento, incluso si el contenido relativo es de solo un segmento de péptido no modificado del 0,18%, todavía se pueden identificar abundantes iones C / z, así como los iones característicos C + 57 / z - 57 producidos por la isomerización del ácido aspártico en la fragmentación etd, logrando así la confirmación de la isomerización del ácido aspártico. Para otras modificaciones posttraduccionales comunes, como la desamida, la oxidación y la glicosilación, se pueden obtener resultados relativamente cuantitativos (figura 8).

Figura 7. confirmación de la isomerización del ácido aspártico mediante la fragmentación de ethcd. La ampliación local de abajo puede observar iones C + 57 / z - 57. (haga clic para ver la imagen grande)

Figura 8. otros resultados cuantitativos relativos de modificaciones posttraduccionales comunes, todos los cuales fueron el promedio de inyección repetida de tres inyecciones dd etchd ms2. A, Oxidación de metionina. B, Desamida de asparagina. C, Amidación de succinilo de asparagina. D, Oxidación del triptófano. E, N - Glicosilación de cadena pesada. (haga clic para ver la imagen grande)

Desliza hacia abajo para ver todo

resumen

Este trabajo muestra los resultados experimentales de la caracterización del ADC kadcyala acoplado a la lisina con un espectrómetro de masas de ultra alta resolución de Nueva generación, exedion pro biopharma. La determinación completa del peso molecular de kadcyala en condiciones no degenerativas puede medir la distribución del número de acoplamiento del fármaco de 0 a 8 sin desazular, y el valor promedio de dar obtenido después del procesamiento por software es de 3,47, que es consistente con el 3,5 reportado; La fragmentación rápida y sensible de ethcd no solo puede lograr una cobertura de secuencia del 100% de la inyección de una sola aguja, una identificación común de modificación posttraduccional y una cuantificación relativa, sino también una identificación de sitios de acoplamiento, identificación de aminoácidos isomerizados, etc., proporcionando resultados creíbles para la caracterización completa de biomoléculas complejas.

Referencias:

[1] Fu, Z., Li, S., Han, S. et al. Conjugado de anticuerpos: el "misil biológico" para la terapia dirigida al cáncer. Sig Transduct Target Ther 7, 93 (2022).

[2] https://assets.roche.com/f/176343/x/38d96ed8ec/fb24e.pdf

Joubert, N., Beck, A., Dumontet, C., Denevault-Sabourin, C. Conjugados anticuerpos-fármacos: la última década. Farmacéutica 2020, 13, 245.

Si necesita cooperar para reimprimir este artículo, deje un mensaje al final del artículo.