I,PCR totalmente automáticoPreparación antes de la operación

Preparación de reactivos y consumibles

Reactivos: incluye plantillas de adn, Primers específicos (positivos y negativos), dntps (cuatro nucleótidos de desoxirribonucleotida), polimerasas de ADN resistentes a altas temperaturas (como la enzima taq), amortiguadores y soluciones iónicas mg m2. Todos los reactivos deben mezclarse después de derretirse por completo para evitar errores de concentración.

Consumibles: utilice un tubo PCR estéril desechable o una placa de 96 agujeros para garantizar una buena estanqueidad y evitar la contaminación cruzada.

Operación de división: completar la preparación del sistema en la zona de preparación del reactivo (mesa de trabajo súper limpia o Gabinete de bioseguridad), Usar guantes y evitar hablar durante la operación, y reducir la contaminación por aerosoles.

Inspección de instrumentos

Asegúrese de que el PCR se coloca en una plataforma sólida horizontal, el voltaje de la fuente de alimentación coincide y está bien conectado a tierra.

Compruebe si el tanque de muestra está limpio para evitar que los residuos afecten la conducción de la temperatura.

Limpie regularmente el tanque de muestras con agua jabonosa y prohíba el uso de bases fuertes, alcohol de alta concentración o disolventes orgánicos.

II. preparación del sistema de reacción

Reactivos mixtos

Añadir proporcionalmente la plantilla de adn, los primeros, los dntps, la polimerasa de adn, el tampón y la solución de mg⁺ al tubo centrífuga estéril, y añadir una cantidad adecuada de agua de doble vapor para determinar el volumen final (se recomienda 15 - 50 μl).

Parámetros clave:

Calidad de la plantilla de adn: evitar la degradación o la contaminación por inhibidores, de lo contrario afectará la eficiencia de la amplificación.

Diseño del primer: asegúrese de la especificidad, evite la estructura Dímero o autocomplaciente, y la temperatura de recocido debe coincidir con el valor del primer TM.

Concentración de mg m2: demasiado alta o demasiado baja inhibirá la actividad enzimática y debe ajustarse de acuerdo con las instrucciones del reactivo.

Sistema de embalaje

Dividir rápidamente la mezcla en un tubo pcr, cubrir la tapa del tubo o cubrir la película especial, centrifugar brevemente (1000 - 2000rpm, 1 minuto) para que el líquido se hunda hasta el Fondo del tubo.

3. configuración del programa del instrumento PCR

Parámetros del programa de temperatura

Degeneración inicial: 94 - 98 ° c, 20 - 30 segundos, separando completamente las cadenas dobles de adn.

Degeneración circular: 94 - 98 ° c, 20 - 30 segundos, manteniendo un Estado de cadena única.

Recocido: 50 - 65 ° c, 20 - 40 segundos, el primer se une a la especificidad de la plantilla (la temperatura de recocido debe optimizarse a través de la PCR gradiente).

Extensión: 72 ° c, fragmento de ADN de 1 minuto / kb, la enzima Taq sintetiza una nueva cadena.

Número de ciclos: 20 - 40 veces, ajustado en función de la abundancia del fragmento objetivo.

Extensión final: 72 ° c, 5 - 10 minutos, asegúrese de que todos los fragmentos se extiendan completamente.

Temperatura de conservación: 16 ° c, 2 minutos (evitar el desgaste excesivo del compresor y prohibir la configuración a 4 ° C para la conservación indefinida).

Configuración funcional avanzada

Gradiente de temperatura: establecer un gradiente de temperatura (como 50 - 65 ° c) en el paso de recocido y probar varias temperaturas de recocido al mismo tiempo para optimizar las condiciones experimentales.

Tasa de calentamiento (tasa rampa): ajuste la velocidad de calentamiento / enfriamiento (como 3 ° C / s) y reduzca el tiempo de reacción.

Incremento del ciclo: aumento de la temperatura o el tiempo después de cada ciclo (por ejemplo, 0,1 ° C por ciclo), adecuado para experimentos especiales como la PCR touchdown.

Guardar y ejecutar programas

Guarde después de introducir el nombre del programa, coloque el tubo PCR en la ranura de la muestra, cierre la tapa térmica y apriete.

Iniciar el programa, que puede monitorear la temperatura y el tiempo en tiempo real a través de la pantalla durante la operación, admite suspender, saltar pasos o terminar el programa.

IV. tratamiento posterior al experimento

Análisis de productos

Inmediatamente después de la reacción, se extrajo el tubo PCR y se analizó el tamaño y la concentración del producto a través de la página de gel de agarosa o la detección por fluorescencia (como sybrgreen).

Si se utiliza el método de etiquetado fluorescente, es necesario asegurarse de que los parámetros del instrumento (como la longitud de onda de excitación y el valor de ganancia) coincidan con el reactivo para evitar la interferencia de la señal de fondo.

Mantenimiento de instrumentos

Antes de cerrar el instrumento, espere a que el módulo de calefacción se enfríe naturalmente a temperatura ambiente para evitar daños por estrés térmico.

Calibrar regularmente el sensor de temperatura para garantizar la precisión de la temperatura (por ejemplo, utilizando el calibrador de punto de fusión estándar).

Limpiar el tanque de muestra y la tapa térmica, comprobar si el anillo de sellado está envejecido y reemplazar los componentes perdidos a tiempo.

V,PCR totalmente automáticoPrecauciones

Prevención y control de la contaminación

Todo el experimento siguió el principio de "no ácido nucleico", utilizando pipetas especiales, cabezas de pistola y ropa de trabajo para evitar la contaminación cruzada.

Establecer un control negativo (sin plantilla) y un control positivo para monitorear la fiabilidad del sistema experimental.

Operación segura

Evite abrir la tapa térmica mientras el PCR está en funcionamiento para evitar quemaduras de alta temperatura o evaporación de la muestra.

Está prohibido limpiar los instrumentos con líquidos corrosivos para evitar daños a los componentes electrónicos.

Investigación de fallas

No hay productos amplificados: compruebe la calidad de la plantilla, el diseño del primer o los parámetros del programa (como la temperatura de recocido demasiado alta).

Bandas no específicas: optimizar la temperatura de recocido o aumentar el tiempo de extensión y reducir la formación de dímeros.

Fluctuación de la temperatura: Póngase en contacto con el ingeniero para calibrar el instrumento y asegurarse de que la uniformidad de la temperatura cumpla con los estándares (por ejemplo ± 0,2 ° c).