Vesículas extracelulares (ev) ha logrado un rápido desarrollo en la última década y ha habido muchos descubrimientos e informes sobre su origen, correlación de enfermedades y diagnóstico y tratamiento. En estas áreas de investigación, esenciales para la caracterización integral del ev, es necesario cubrir partículas individuales del ev y análisis generales, como tamaño de partícula, potencial, concentración, distribución del tamaño de partícula y detección de proteínas características relacionadas con el ev, como cd9, cd63, cd81, Alix y tsg1012 - 5. Si se quiere realizar un análisis más profundo del fenotipo del ev, se debe realizar un análisis del fenotipo del EV utilizando métodos como Western blotting, Elisa o marcadores inmunológicos monocelulares / globales.
En la actualidad, no existe una forma de vincular la detección de proteínas en una sola burbuja con el conjunto.Distribución del tamaño de las partículasCombinado con la medición de la concentración. El análisis de rastreo de nanopartículas (nta) es una tecnología aplicada para caracterizar la distribución del tamaño de las partículas ev. NTA se basa en la ecuación de Stokes - einstein, rastreando partículas individualesMovimiento BrownPara determinar el tamaño de un solo grupo de ev y ev. La NTA utiliza láseres para irradiar partículas, lo que en teoría puede lograr la estimulación específica de los tintes fluorescentes y la detección de EV (nta - fl) marcados con fluorescencia.Sin embargo, actualmente solo unos pocos estudios han evaluado rigurosamente NTA - FL y estos se basan en dianas atípicas de proteínas eV o marcadores inmunológicos no específicos..
Universidad de Tufts (ee.uu.)Universidad Tufts) los investigadores informaron de un algoritmo de optimización para el uso de un solo EV de etiquetado inmunológico fluorescente en NTA - fl, lo que hace que el etiquetado inmunológico y la detección de una sola burbuja basado en NTA sean más precisos con la distribución del tamaño de las partículas y el análisis de concentración. El algoritmo puede mejorar efectivamente la credibilidad de los resultados de las pruebas de NTA y proporcionar una herramienta poderosa para estudiar más a fondo las funciones y mecanismos de ev..
En estudios previos, los investigadores encontraron利用Agencia Tributaria NacionalLlevar a caboEVFluorescencia del análisis de subtipo/.El método de comparación de luz dispersa se desviará de los datos.. normalmente, la relación entre el área rodeada por la curva de fluorescencia (fm) y el área rodeada por la curva de luz dispersa (lsm) puede representar la pureza del ev. Pero estos investigadores encontraron durante el análisis que en la prueba 1, 2, 4 (tabla 1, figura 1), la relación entre FM (línea azul) y lsm (línea roja) es superior al 100%, lo que indica una pureza EV superior al 100%, lo que es claramente irrazonable, y los resultados de esta prueba muestran:1. durante la detección de fluorescencia, puede haber una gran cantidad de señales falsas.
2. las limitaciones técnicas del sistema NTA hacen que el lsm no pueda detectar EV muy pequeño u otras partículas con bajo índice de refracción.La detección de EV en modo de luz dispersa es incompleta y algunos datos de EV no se detectan, lo que hace que el área de lsm sea pequeña, lo que resulta en una relación superior al 100%.
3. los investigadores también encontraron que el modo FM también tiene picos de señal obvios en áreas por debajo de 50 nm, mientras que en comparación con el modo lsm, su señal por debajo de 50 nm básicamente se atenua a 0, lo que también puede ser una de las razones por las que la relación es superior al 100%.En concreto, esto puede deberse a que las moléculas fluorescentes libres no se eliminan adecuadamente y a que las proteínas libres del sistema están marcadas por moléculas fluorescentes, lo que resulta en un aumento de la señal fluorescente en zonas de pequeño tamaño.
Tabla 1 Relación entre el área de fluorescencia (fm) y el área de luz dispersa (lsm) de diferentes muestrasFigura 1 resultados de las pruebas NTA de diferentes muestras en modo FM y modo lsm
Para resolver esta situación, los investigadores propusieron dos métodos de evaluación:
El primer métodoEs el método de cálculo tradicional, es decir, calcular el número de partículas mayores de 50 nm en la muestra y comparar el número de partículas en FM y lsm para obtener la proporción entre FM y lsm. (figura 2b, c)
El segundo enfoqueEs el método de cálculo optimizado, que calcula las áreas superpuestas entre las curvas de distribución del tamaño de las partículas obtenidas por los dos métodos y las compara con el número total de partículas mayores de 50 nanómetros en el lsm para obtener la proporción de áreas superpuestas. (figura 2d)
Durante el estudio, los investigadores destacaron su elección para la selección del tamaño de las partículas. Para analizar el EV con mayor precisión, los investigadores redujeron el alcance del análisis a50 - 200 nanómetros. Este rango se eligió porqueLa mayoría de los tamaños de ev están dentro de este rango. además,El lsm tiene una capacidad limitada para detectar partículas menores de 50 nanómetrosPor su parte, las partículas superiores a 200 nanómetros pueden no ser ev. por lo tanto, se reduce el análisis a50 - 200Los nanómetros pueden excluir eficazmente otros tipos de partículas y mejorar la precisión de los resultados del análisis..
Figura 2 diagrama esquemático del algoritmo de etiquetado inmunológico basado en NTA
Basándose en este algoritmo de optimización, los investigadores analizaron los datos de los seis grupos de muestras anteriores, y los resultados de los datos mostraron que la pureza del EV cayó a menos del 100%.
Tabla 2 Relación entre el área de fluorescencia (fm) y el área de luz dispersa (lsm) de diferentes muestras después de la optimización del algoritmo (sa)
El algoritmo anterior utiliza el etiquetado de puntos cuánticos y la tecnología NTA - FL para identificar y analizar eficazmente EV de diferentes subtipos a nivel de una sola burbuja comparando los resultados del modo fluorescente (fm) y el modo de luz dispersa (lsm), y proporciona información más precisa sobre la distribución del tamaño de las partículas. Sin embargo, aunque la tecnología NTA - FL y los algoritmos de optimización pueden mejorar efectivamente la precisión del análisis del subtipo ev, también es necesario reconocer que la tecnología NTA tiene algunas limitaciones en los principios subyacentes.NTA está detectando EV muy pequeño oDistribución amplia del tamaño de las partículasdeMuestra (especialmente la muestra ev)Cuando hay un ciertodificultad. Por lo tanto, aunque la tecnología NTA - FL y los algoritmos de optimización pueden mejorar la precisión de la distribución del tamaño de las partículas y el análisis de concentración, peroEl cuello de botella tecnológico de NTA no se ha superado, la optimización posterior del algoritmo y si el método de etiquetado fluorescente puede estar enObtener los resultados correctos sobre la base incorrectaTodavía hay que ser cautelosos para no depender demasiado de los datos obtenidos por esta tecnología.El medidor de tamaño de partícula nanocolter utilizaPrincipio KurtRompiendo las limitaciones de los principios ópticos, se puede analizar con precisión cada partícula poroso para lograr una verdadera detección de partículas únicas, que tiene una amplia distribución del tamaño de las partículas.Sistema dispersoLas muestras tienen un mejor efecto de medición. Y no se ve afectado por las propiedades ópticas de la muestra, como el índice de refracción y la absorbancia, los datos no se ajustan, y el Estado de la muestra de reacción más real.
