Resumen
La secuenciación del ARN unicelular (scrna - seq) es una técnica utilizada para caracterizar sin desviaciones la expresión de genes en muestras de células y tejidos complejos. Aunque el scrna - SEQ Chedi ha cambiado la biología moderna, sigue siendo técnicamente desafiante y suele ser costoso. Las soluciones actuales en el mercado permiten analizar eficazmente un pequeño número de células cuando tienen un pool inicial de decenas de miles de células. Sin embargo, todavía faltan esquemas simplificados para la preparación de bibliotecas scrna - SEQ para el tratamiento de poblaciones celulares raras. Aquí, hemos desarrollado un nuevo método de detección de placas de agujero para scrna - SEQ rentable y altamente sensible. Este flujo de Trabajo apoya la preparación de bibliotecas de muestras raras de grupos celulares raros. En este nuevo flujo de trabajo (figura 1), utilizamos dispencell y cabezales de detección dedicados (seed biosciences, suiza), con un sistema de preparación de bibliotecas unicelulares dedicado y optimizado (kit BRB - SEQ de alta sensibilidad mercurius, Alithea Genomics， Suiza).
Distribución unicelular
En primer lugar, antes de la preparación de la Biblioteca de secuenciación, probamos la capacidad de dispencell para distribuir células individuales en un amortiguador de lisis dedicado. La línea de linfocitos Se descongela del vial congelado, se transmite dos veces y luego se cosecha en una suspensión unicelular. Filtrar las células con un filtro celular de 10 μm (miltenyi biotec, alemania), contar y diluir en una solución de distribución de metilcelulosa sin rnase (spenme, Seed biosciences) a una concentración final de 2 × 104 células / ML. A continuación, se cargan 200 células de la suspensión celular con la cabeza de succión de detección spencell. Establecer dispencell para distribuir células individuales a una placa de 384 poros precargada con un tampón de lisis de 4,2 μl (kit HS BRB seq, alishea genomics). Los primeros 96 agujeros se distribuyen durante unos 7 minutos. Luego, se detuvo la distribución porque teníamos suficientes muestras para el análisis aguas abajo.
Control de calidad unicelular
Inmediatamente después de la asignación, utilizamos el software dispenssoft desarrollado por Seed Biosciences para el reprocesamiento de control de calidad unicelular. Cada agujero de la placa del agujero está representado por una matriz codificada por color (figura 2.a). cuando el agujero contiene una sola célula, el software lo marca como verde, mientras que el agujero rojo contiene cero o más células y debe descartarse. Para distinguir entre fragmentos y células, se establece un umbral mediante el control de puerta de un histograma basado en el tamaño (figura 2.b). Solo los picos por encima del umbral se cuentan como células.
Aquí obtuvimos 77 poros unicelulares (80% de tasa de aislamiento unicelular). Con dispensoft, los datos de resistencia originales también se pueden utilizar para registrar el proceso. Se puede comprobar manualmente cada curva de resistencia. Un solo pico es una característica de una sola célula (figura 2.c), mientras que varias células producen múltiples picos. Esto sugiere que dispencell es capaz de distribuir células individuales en el amortiguador de lisis con un proceso simple, rápido y trazable de wanquan.