Resumen
La bioimpresión 3D se define como una estructura 3D funcional o un modelo de tejido artificial de materiales celulares y biocompatibles. 1 esta tecnología cambia el campo de la ingeniería organizacional al permitir la creación de estructuras con diseños predefinidos complejos, asegurando al mismo tiempo la repetibilidad. Varios métodos basados en la bioimpresión 3D han sido reportados para la ingeniería de diversos tejidos, como cartílagos, 2 huesos, 3 y regeneración de la piel. 4 esta tecnología también se utiliza para crear nuevos modelos de tumores preclínicos. De hecho, como modelo de cultivo celular 2d cada vez más cuestionado por su falta de predictividad, la bioimpresión 3D se ha convertido en una alternativa para evitar este problema procesando diferentes moléculas derivadas de la matriz celular y extracelular, el modelado / exhibición del microambiente tumoral (tme). Muchos modelos oncológicos basados en la bioimpresión 3D incluyen cáncer de pulmón, cáncer de mama 5 y Glioblastoma 6. 7 estos modelos muestran ventajas en el diseño y son flexibles y repetibles en comparación con otras estrategias como las bolas celulares y los organoides. El cáncer de ovario es un importante problema de salud pública, y la bioimpresión 3D todavía se está estudiando como modelo de cáncer de ovario. En este tipo de tumores, se muestra una estrecha interacción entre los fibrocitos relacionados con el cáncer (caf) y las células cancerosas, desempeñando un papel importante en la invasión y resistencia al cáncer. 8, 9 por lo tanto, los cafs son la clave para el diseño de modelos de cáncer de ovario.
ventaja
El cribado de alta connotación y la transfección instantánea ayudan a caracterizar y verificar los experimentos de bioimpresión 3D • La expresión génica instantánea es una herramienta poderosa para aumentar la versatilidad de los modelos de bioimpresión 3D • Las herramientas de análisis de longitud de onda múltiple son necesarias para aprovechar al máximo las potentes funciones de los modelos de bioimpresión 3D para estudiar la interacción de diferentes grupos de tipos celulares dentro del modelo. en esta nota de aplicación, la bioimpresión 3D se utiliza para crear modelos de cáncer de ovario que contengan células cancerosas (células skov3) y células de fibra CAF (células mewo). Las células skov3 fueron transfundidas con el plasmídeo jetopotimus (polyplus) GFP y las células mewo fueron teñidas con celltracker y Orange cmra Dye (thermofisher). Ambos tipos de células están contenidos en gelatina - alginato - a base de hidrogel para obtener estructuras similares a tumores cilíndricos para su uso en la formación. La homogeneidad del modelo y la repetibilidad de la distribución celular dentro de estos tumores se evaluaron con el sistema de imágenes imagexpress pico.
Resultados y discusión
Como se muestra en la figura 1, la imagen estructural bioimpresa muestra que las células skov3 que expresan GFP y las células mewo teñidas de fluorescencia se distribuyen uniformemente en la matriz de alginato de gelatina (figuras 1A y b). Esto es muy importante porque la distribución uniforme de células homogéneas en tinta biológica es un factor importante a tener en cuenta durante la impresión 3D 12. además, el TME natural es un tipo de célula conocido por contener múltiples interacciones estrechas. 13 por lo tanto, es fundamental recrearlo, al tiempo que se construyen modelos tumorales in vitro para facilitar la interacción entre el cáncer y las células estromales.
Por su parte, en los tumores se deben combinar varios tipos de células para simular mejor la heterogeneidad del tme, y el número y la proporción de cada tipo de célula deben controlarse para garantizar la repetibilidad. Imagexpress pico es un especialmente adecuado para este tipo de control, ya que permite capturar múltiples imágenes microscópicas de forma rápida y fácil. El software cellreporterxpress permite cuantificar varias células incluso con muestras gruesas, que se pueden implementar con la proyección máxima de Z - Stock. En esta nota de aplicación, este sistema se utiliza para analizar nuestro modelo tumoral bioimpresa que muestra una buena repetibilidad en términos de número y proporción de células en seis estructuras bioimpresas, con un número promedio de células skov3 (fitc de recuento celular) de 837 ± 200 (desviación estándar ≤ 25%). Para las células mewo (tritc de recuento celular), el número medio fue de 3.264,50 ± 462 (std ≤ 15%).

La figura 1 analiza el tinte cmra de la estructura de bioimpresión 3D de las células skov3 que contienen el plasmídeo GFP modificado y las células mewo teñidas por celltracker orange. A) imágenes fitc y tritc de estructuras bioimpresas en 3D en el agujero B3 tomadas con el sistema imagexpress pico (4x, z - stock). B) analizar las mascarillas para el recuento de células fitc y tritc creadas con el software cellreporterxpress. C) número medio de células en los canales fitc y tritc de la muestra (5 hoyos, teñidos y transfundidos) y controles negativos (3 hoyos, sin teñir y sin transfundir). D) evaluación de la eficacia de la transfección, utilizando el plasmídeo GFP y el kit de transferencia jetopticus - polyplus - Transform - Transform (porcentaje de células positivas fitc / células positivas tritc).

Materiales y métodos
Preparación de hidrogel
En el caso de la preparación de hidrogel, se pesan las masas necesarias de gelatina y polvo de alginato de sodio, se someten a luz ultravioleta durante 1 hora y luego se disuelven en el medio de cultivo necesario lowest mixto (mem) en el eaglemedium modificado por dulbeco, complementado con un 10% de suero bovino fetal. La solución resultante se mantiene a 37 ° C durante la noche bajo agitación magnética y se homogeneiza completamente. La transfección celular y la tinción, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizaron el Plásmido jetopotimus (polyplus) GFP para transfundir las células skov3. 10 en resumen, una cantidad adecuada de ADN se diluye en el amortiguador de jetoptimus y se añade adecuadamente el reactivo de transfección de jetoptimus. La solución de transfección se conserva a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego se añade a las células skov3 cultivadas, cultivadas en un matraz T75 con un grado de fusión del 60 - 80%. Las células mewo se tiñen con el tinte celltracker Orange cmra (thermo fisher), siguiendo las instrucciones del fabricante. 11 en resumen, disolver el tinte en Dmso para preparar la solución de trabajo y luego diluirlo en el medio de cultivo mem. Las células fueron incubadas a 37 ° C durante 30 minutos. A continuación, se extrae la solución del reactivo y se sustituye por una fresca.completoMedio de cultivo.

Figura 2 diagrama esquemático del método utilizado para la bioimpresión y la imagen de la estructura del modelo de cáncer de ovario.