I,Tubo centrífuga de ultrafiltraciónOptimización de parámetros centrífuga
Velocidad y tiempo
Se recomienda que la centrifugación inicial comience al 70% de la velocidad recomendada (por ejemplo, centrifugación de 3000 × G durante 10 minutos) y se ajuste gradualmente a 4000 × G después de observar el flujo, pero no supere el límite de tolerancia de la membrana filtrante.
El tiempo de procesamiento típico es de 10 - 30 minutos, dependiendo del peso molecular interceptado (mwco) y el volumen de la muestra.
Control de temperatura
La centrifugadora debe preconfriarse a 4 ° C para reducir la adsorción de desnaturalización térmica. El ambiente de baja temperatura puede prolongar la vida útil de la película, pero hay que tener en cuenta que el tiempo de concentración puede alargarse.
Aceleración y equilibrio
La aceleración centrífuga se ajusta a la marcha más baja para reducir la presión sobre la película.
Asegúrese de que la calidad del tubo de ultrafiltración emparejado esté equilibrada con el Centro de gravedad, y la posición y dirección del filtro sean consistentes para evitar temblores o daños durante el proceso de centrifugación.
II. estrategias de mejora de la tasa de recuperación
Selección y pretratamiento de la membrana filtrante
De acuerdo con el peso molecular objetivo, se selecciona una membrana de ultrafiltración mwco 2 - 3 veces más pequeña que la molécula objetivo. Por ejemplo, cuando el peso molecular de la proteína objetivo es de 35 kda, se selecciona un tubo de ultrafiltración de 10 KDA para interceptar el peso molecular.
La película de ultrafiltración del tubo centrífuga de ultrafiltración recién comprado contiene trazas de glicerina, que deben remojarse en agua pura o tampón y colocarse en el refrigerador para preconfriar durante 10 minutos antes de su uso. Después de eso, vierta agua pura y luego coloque el tubo de ultrafiltración sobre hielo para preconfriar durante 2 - 5 minutos.
Procesamiento y adición de muestras
Las muestras se filtran con una película filtrante de 0,22 micras con antelación para evitar que las partículas bloqueen la película filtrante.
Agregue lentamente la muestra al tubo de ultrafiltración y el nivel del líquido no supere la marca máxima. Al agregar muestras, la operación debe ser ligera para evitar destruir la estructura de la membrana.
Concentración y elución
Durante el proceso de centrifugación, se suspende cada 5 minutos y se utiliza una pistola de pipeta para soplar suavemente la capa de interceptación para evitar que las moléculas grandes se acumulen para formar una capa de polarización de concentración.
El volumen de retención se controla entre 1 / 10 y 1 / 20 del tamaño original de la muestra. Un múltiplo de concentración demasiado alto puede conducir fácilmente a la acumulación de proteínas, que se pueden agregar amortiguadores a mitad de la ultrafiltración para reemplazarlos y condensarlos por etapas.
Para las muestras pegajosas (como la glicerina o la sacarosa), es necesario reducir la velocidad en un 10% - 20% y prolongar el tiempo de centrifugación.
Operación de reciclaje
Después de la centrifugación, las moléculas grandes permanecen en la parte superior, y las moléculas pequeñas y los disolventes entran en la parte inferior a través de la membrana. El filtrado del tubo exterior es una sustancia Molecular pequeña y un disolvente; El líquido del tubo interior es una sustancia macromolecular.
Si es necesario recoger materiales macromoleculares, se toma otro tubo exterior, y el tubo interior se invierte 1000 × G para centrifugar durante 1 - 2 minutos.
III. problemas y soluciones comunes
Fugas de proteínas o no se detectan proteínas
Causas: selección inadecuada de la membrana filtrante, parámetros centrífuga inadecuados, concentración inicial demasiado baja de la muestra, etc.
Solución: vuelva a seleccionar la membrana filtrante mwco adecuada, ajuste los parámetros de centrifugación y asegúrese de que la concentración inicial de la muestra sea superior a 25 μg / ML.
La película está bloqueada o el flujo es demasiado lento.
Causas: demasiadas partículas en la muestra, contaminación de la membrana filtrante, etc.
Solución: filtrar las muestras con antelación, limpiar o reemplazar regularmente la película filtrante. Cuando se encuentra la película bloqueada, remoje en 0,1m NaOH durante 1 hora y enjuague tres veces con agua pura.
Baja tasa de recuperación
Razones: adsorción de la membrana filtrante, operación inadecuada, etc.
Solución: cierre la membrana filtrante con un 1% BSA con 30 minutos de antelación para reducir la adsorción no específica. Preste atención a la suavidad durante la Operación para evitar destruir la estructura de la membrana.
Precipitación de la retención después de la ultrafiltración
Razones: concentración excesiva de proteínas, Buffer inadecuado, etc.
Solución: ultrafiltración simultánea con varios tubos de ultrafiltración para reducir la concentración; Cambie por un Buffer diferente hasta que la proteína no se deposite. Para la precipitación, se puede disolver con urea de 8m y volver a centrifugar.
IV. mantenimiento y mantenimiento
Limpieza y desinfección
El tubo centrífuga de ultrafiltración desechable se desecha directamente después de su uso.
Si es necesario reutilizarlo, el tubo de ultrafiltración usado se limpia repetidamente 5 veces con agua pura, luego se remoja en NaOH 0,1 m durante 1 - 2 horas, luego se limpia con etanol al 20% y se limpia 3 veces con agua ultrapura o amortiguador. Por lo general, no se recomienda reutilizar el tubo de ultrafiltración más de 5 veces.
Conservación a largo plazo
Conservación a corto plazo: remojar con 0,1m NaOH durante 1 - 2 horas, limpiar con agua pura 3 veces y luego remojar con etanol al 75%, asegúrese de mantener la película filtrante húmeda y no cultivar bacterias.
Conservación a largo plazo: remojar con 0,1m NaOH durante 1 - 2 horas, limpiar con agua pura 3 veces y luego remojar con etanol al 20%, asegúrese de mantener la película filtrante húmeda y no cultivar bacterias.