Sintético automatizado de péptidosAnálisis de todo el proceso de operación: pasos clave desde la selección de resina hasta la purificación del producto

I. selección de resina: sentar las bases para la síntesis

La resina es el portador central de la síntesis de Estado sólido, y su tipo afecta directamente la hinchazón, la hidrofobicidad y la estructura del producto final del péptido.

Resina reticulada de poliestireno - benceno - Dietileno (resina wang)

Características: gran espacio de red, adecuado para la síntesis de cadenas de péptidos largas; Alta estabilidad química y liberación de péptidos a través de tratamientos con ácidos moderados, como el tfa.

Escenario aplicable: síntesis convencional de péptidos, especialmente péptidos con estructura de ácido nucleico C - terminal.

Resina rink amide

Características: soporte para la amidación C - terminal, adecuado para la síntesis de péptidos al final del enlace amido.

Ventajas: amplia compatibilidad y reducción del riesgo de efectos secundarios.

Resina peg - ps

Características: excelente hinchazón, puede reducir la resistencia al sitio espacial y mejorar la eficiencia de síntesis de péptidos hidrofóbicos.

Caso: al sintetizar polipéptidos que contienen aminoácidos hidrofóbicos continuos (como leu, phe), la resina Peg - ps puede mejorar significativamente la pureza bruta.

Base de selección: evaluación integral de la estructura del extremo c (ácido nucleico / amida), la longitud de la secuencia y la hidrofobicidad del péptido objetivo. Por ejemplo, los polipéptidos que contienen aminoácidos sensibles como Cys e his deben seleccionar resina sensible al ácido (como la resina de 2 - clorotriptolueno) para evitar reacciones secundarias en la cadena lateral.

II. preparación y calibración del equipo: garantizar un control preciso

Inspección del equipo

Se confirma que la botella de almacenamiento de disolvente y la tubería de gas están bien conectadas y que todos los componentes del instrumento no están dañados.

Rango de presión de inspección: el aire comprimido (air) debe estar en 60 - 100 PSI y el nitrógeno (n2) debe estar en 5 - 10 psi.

Calibración del sistema

Realizar pruebas como temperatura, Código de barras, agitación del reactor, aguja de extracción de líquido y empuje de botellas de aminoácidos.

Calibrar el módulo de detección ultravioleta para garantizar un monitoreo preciso de la eficiencia de la desprotección.

Selección del recipiente de reacción

Elija el recipiente adecuado de acuerdo con la escala sintética (por ejemplo, 20 - 50 μmol) para evitar la reacción del disolvente con el material del recipiente.

Caso: debido a que un laboratorio no ha calibrado el módulo ultravioleta, se produce una desviación en el monitoreo de la eficiencia de la desprotección, y la tasa final de pérdida de péptidos alcanza el 15%; La tasa de ausencia se redujo al 3% después de la calibración.

III. pasos sintéticos: control de ciclo de desprotección, acoplamiento y lavado

Hinchazón y lavado de resina

La resina hinchada con Diclorometano (dcm) se utilizó durante 2 horas, y después de secarse, se lavó tres veces con DMF para eliminar las impurezas.

Desprotección

Reactivos: 40% de solución de ácido trifluoroacético / Diclorometano (incluido 5% tis como eliminador).

Condición: temperatura ambiente o 50 ° c (incluida la secuencia app para evitar altas temperaturas y evitar la formación de aspartitide).

Monitoreo: se confirma la eliminación completa de fmoc a través de la detección ultravioleta (290 nm) (disminución de la Absorbancia ≥ 95%).

Reacción de acoplamiento

Activación del reactivo: mezclar aminoácidos con hctu / dipea (15 - 30 minutos a temperatura ambiente) o TIC / oxima (2 minutos a 90 ° c).

Estrategia de alimentación:

Secuencia convencional: 5 - 7,5 veces aminoácidos equivalentes, suplementos paso a paso (por ejemplo, 5 veces inicial, 2,5 veces más cuando el monitoreo ultravioleta es insuficiente).

Secuencia difícil (como pro continuo): con "asistencia de calentamiento + tiempo de reacción prolongado" (2 veces a 50 ° c, 5 minutos cada vez).

Lavado y sellado

Después de cada paso de reacción, se lava tres veces con DMF para eliminar los reactivos no reaccionados.

Después de completar el acoplamiento, se realiza una reacción de sellado final (por ejemplo, el bloqueo con anhidrato de sodio / dipea no reacciona con aminoácidos).

Soporte de datos: en la síntesis de un péptido antibacteriano, al optimizar las condiciones de acoplamiento (5 veces equivalente + 50 ° C de calentamiento), la pureza bruta aumentó del 66% al 84%, y el consumo de reactivos se redujo en un 30%.

IV. lisis y recogida de péptidos gruesos: liberación de productos objetivo

Configuración del líquido de craqueo

Fórmula: 95% TFA + 2,5% agua + 2,5% tis (eliminador).

Después de preconfriar a 0 ° c, agregue el reactor y revuelva la reacción durante 2 horas.

Separación de productos

El líquido de craqueo se extrae a través de una membrana filtrante, se elimina la resina y se lava la resina tres veces con TFA para fusionar el filtrado.

Concentración y precipitación

El evaporador rotativo concentra el filtrado en un volumen pequeño y agrega el éter de metilterc - butilo (mtbe) para precipitar el péptido.

Centrifugar (10000rpm, 10 minutos) para recoger la precipitación, lavarla tres veces con éter frío y secar para obtener péptidos gruesos.

Caso: en la síntesis de péptidos de una vacuna, al optimizar el tiempo de craqueo (de 3 horas a 2 horas), la tasa de recuperación del producto aumenta en un 12% y los subproductos disminuyen.

V. purificación y liofilización: mejorar la pureza del producto

Purificación por Cromatografía líquida de alto rendimiento (clar)

Condiciones: columna invertida c18, fase móvil a (0,1% TFA / agua), fase móvil b (0,1% TFA / nitrilo).

Elución gradiente: la fase B sube del 10% al 60% en 0 - 30 minutos, recogiendo el pico objetivo.

Tratamiento liofilizado

La solución polipéptida purificada se condensa al vapor y se transfiere al vial liofilizado.

Calentamiento programático: preenfriado a - 80 ° c, vacío inferior a 50 mtor, calentamiento a 25 ° C para mantenerse durante 24 horas.

Soporte de datos: después de la purificación por clar, la pureza del péptido aumentó del 85% al 98%; Después de la liofilización, el contenido de agua del producto fue inferior al 2%, y la estabilidad aumentó significativamente.

VI. monitoreo en tiempo real y análisis de datos: optimización de circuito cerrado

Monitoreo ultravioleta y protección

　　Sintético de péptidos químicosRegistre los cambios de absorción ultravioleta de cada paso de desprotección y genere una curva de eficiencia de desprotección.

Prueba César (prueba de ninhidrina)

Tomar 10 - 15 cuentas de resina y calentarlas a 110 ° C durante 5 minutos después de agregar el reactivo de Ninhidrina para juzgar la finalización del acoplamiento a través del cambio de color.

Registro e informe de datos

Registre en detalle la cantidad de reactivos, el tiempo de reacción, la temperatura, la presión y otros parámetros para generar informes experimentales.

Caso: una empresa analiza datos históricos introduciendo algoritmos de ia, predice dificultades de síntesis (como áreas de aminoácidos de rama beta) y ajusta las condiciones de reacción con antelación para acortar el ciclo de síntesis en un 40%.