El analizador de PCR cuantitativo fluorescente realiza una cuantificación precisa de los genes monitoreando los cambios en la señal fluorescente en tiempo real, combinada con el análisis del valor CT y la curva estándar. sus principios básicos y pasos de implementación son los siguientes:

Principios básicos

Añadir grupos fluorescentes (como tintes sybrgreen o sondas taqman) al sistema de reacción de amplificación PCR hace que la intensidad de la señal fluorescente cambie simultáneamente con el aumento de la producción de expansión. Cada vez que se completa un ciclo pcr, el instrumento recoge una señal fluorescente y genera una curva de amplificación. Al establecer un umbral de fluorescencia (generalmente 10 veces la desviación estándar de la señal basal), se determina el número de ciclos (valores ct) cuando el producto amplificado alcanza el umbral. El valor CT está relacionado negativamente con el número de plantillas iniciales, es decir, cuanto mayor sea el número de plantillas iniciales, menor será el valor Ct.

Pasos para lograr

Construcción de la curva estándar: dilución gradiente con una concentración conocida de estándares, como ADN plasmídico purificado o ARN transcrito in vitro, amplificación PCR con diferentes concentraciones de estándares como plantilla. La curva estándar se dibuja tomando el logaritmo del número de copias del producto estándar como Coordenadas horizontales y el valor CT como coordenadas longitudinales. Cuando el rango de concentración estándar está en el número de copias de 10 metros cuadrados a 10 metros cuadrados, la concentración de la plantilla generalmente presenta una buena relación lineal con el valor CT (coeficiente de correlación R m2 > 0,99), lo que garantiza que se pueda cuantificar con precisión dentro de este rango.

Detección de muestras desconocidas: ampliar simultáneamente las muestras desconocidas con el estándar y reemplazar su valor CT en la fórmula de la curva estándar para calcular el número de copias del gen objetivo en la muestra. Por ejemplo, si la fórmula de la curva estándar es y = 31372x + 38.201 (y es el valor ct, X es el logaritmo del número de copias), el tamaño inicial de la plantilla de la muestra se puede obtener mediante cálculo inverso.

Corrección genética del ginseng interno (cuantificación relativa): cuando es necesario comparar las diferencias en la expresión génica entre diferentes muestras, se seleccionan los genes mayordomos (como gapdh, beta - acción) como parámetros internos, calculando la diferencia en el valor CT (△ ct) entre el gen objetivo y el gen del ginseng interno, y utilizando aún más el método△ CT para analizar la expresión relativa, eliminando el impacto de las diferencias en el tamaño de la muestra y la eficiencia de respuesta.