Resumen

Las proteínas juegan un papel vital en los sistemas biológicos, participando en los diversos procesos metabólicos necesarios para la vida. Debido a su importancia, son ampliamente utilizados en industrias como la farmacéutica, donde contribuyen al desarrollo de medicamentos (como antibióticos y biofarmacéuticos), así como a la producción de alimentos, donde actúan como ingredientes clave en los suplementos nutricionales. Dada su uso previsto en aplicaciones relacionadas con la salud, es fundamental lograr una alta pureza en el proceso de extracción de proteínas.

Entre los diversos métodos de purificación disponibles, la cromatografía se utiliza con frecuencia por su eficacia en la separación de proteínas. Las técnicas comúnmente utilizadas incluyen intercambio de iones, interacción hidrofóbica, afinidad, fase inversa y cromatografía de filtración de gel.La cromatografía de fase inversa se ha convertido en la herramienta más importante en la separación de péptidos y pequeñas proteínas. Debido a su destacada capacidad de separación, los péptidos a menudo se pueden separar, incluso si solo difieren en un residuo de aminoácidos.Además, la cromatografía de fase inversa utiliza una mezcla de agua como fase móvil, por lo que el método es compatible con muestras acuosas. La cromatografía de fase inversa se utiliza ampliamente en la detección de impurezas en estudios de investigación o en la purificación a gran escala de medicamentos terapéuticos para eliminar compuestos no deseados. Debido a que la cromatografía de fase inversa utiliza disolventes orgánicos polares como fase móvil, este método solo puede usarse en compuestos capaces de soportar condiciones estrictas.Este tipo de cromatografía suele ser adecuado para péptidos y proteínas pequeñas y estables,Estas proteínas se reorganizan espontáneamente después de la purificación.

La cromatografía de fase inversa se puede realizar como método flash o método de Cromatografía líquida de alto rendimiento. Estas dos tecnologías se utilizan con frecuencia, pero con diferentes propósitos:La cromatografía flash se utiliza principalmente como paso previo a la purificación para purificar un gran número de muestras con una resolución suficiente, mientras que la Cromatografía líquida de alto rendimiento tiene como objetivo obtener la resolución más alta (pureza) en condiciones de carga más baja.. Por lo tanto, las diferencias entre las dos técnicas son el material utilizado para fijar la fase (diferentes tamaños de partícula), el tamaño de la columna (diámetro interior y longitud) y el caudal de la fase móvil.

Tabla 1: diferencias entre la cromatografía flash y la Cromatografía líquida de alto rendimiento

Las proteínas son moléculas complejas que adoptan una estructura tridimensional específica determinada determinada por la interacción entre los residuos de aminoácidos y los disolventes circundantes. Este plegado estructural define su radio hidrodinámico, que describe sus dimensiones efectivas en soluciones acuosas.En la cromatografía, la capacidad de las proteínas para penetrar en los poros de las fases fijas afecta directamente la eficiencia de la separación.Los poros más grandes en los medios cromatográficos permiten un mejor acceso a la fase fija y mejoran la resolución de la separación de proteínas. El tamaño de las partículas de la fase fija también puede afectar la interacción de las proteínas con la superficie. Las partículas más pequeñas proporcionan más sitios de interacción, lo que conduce a una separación más pronunciada, mientras que las partículas más grandes limitan el área de contacto y reducen la resolución.Optimizar los poros y el tamaño de las partículas es una condición necesaria para lograr una purificación eficiente de proteínas.

El comportamiento de las proteínas durante la separación por cromatografía se ve afectado en gran medida por su carga eléctrica, que depende del pH del disolvente. Para mantener la estabilidad de la proteína, generalmente se purifica en una solución tampón para mantener su estructura natural.En algunos casos, cambiar el pH es una estrategia eficaz para cambiar la carga eléctrica de las proteínas y mejorar la eficiencia de la separación.

Equipo experimental

Reactivos y materiales

Pasos experimentales

Los cromatógrafos de este estudio se generaron en las siguientes condiciones experimentales:

Cuadro 3. gradientes 1

Cuadro 4. gradientes 2

Cuadro 5. gradientes 3

Experimentos previos han demostrado que el uso de columnas preppure c18wt (300 m) con 10 μm como fase fija permite una separación óptima de proteínas. La figura 1 es el gráfico de la muestra, utilizando preppure c18wt (300 m), 10 micras, bajo un gradiente de una referencia similar (gradiente 1: 30% - 90%, más de 10 minutos). A diferencia de la literatura de referencia, según el orden de elución, solo se observaron los siguientes picos: proteína folicular, proteína folicular, lisozima, Transferrina folicular y albúmina folicular. Estas diferencias se pueden atribuir a las diferencias en la calidad y el origen de los huevos utilizados para la preparación de las muestras.

Para * las condiciones de separación, realizamos varios experimentos para optimizar la resolución de la proteína objetivo. La figura 2 muestra el mapa de cromatógrafos obtenido en gradientes 2: 10%, 20% y 30% de preppure c18wt (300 m), 10 μm, lo que favorece la separación de la proteína objetivo.

A continuación, conFigura 2Con referencia a las condiciones experimentales, se estudiaron los efectos del tamaño del poro y el tamaño de las partículas.

Figura 3Para yFigura 2El cromatógrafo en las mismas condiciones, utilizando C18 no WT (100 m) (preppure c18, 10 micras) para estudiar el efecto del tamaño del agujero. Aunque la señal ultravioleta indica una mayor resolución de los dos primeros picos en comparación con el c18wt, la baja absorción y la señal elsd indican que no se ha producido una separación efectiva. El gran tamaño del agujero (300) del c18wt permite a las proteínas penetrar en las partículas e interactuar eficazmente con las fases fijas. Por el contrario, preppure C18 (100 m), 10 μm no logran la separación, ya que las proteínas solo pueden interactuar con la superficie exterior de las partículas. Esta interacción limitada reduce el número de pasos de equilibrio entre adsorción y desorción, lo que afecta la eficiencia de la separación.

Figuras 4 y 5Muestra que enFiguras 2 y 3En las mismas condiciones (gradiente 3), se utiliza una columna de flash: flashpure Select C18 (100 m), 30 μm y ECOLEX C18 (100), un diagrama de 50 μm. Cuando el tamaño de las partículas es superior a 10 micras, el efecto de separación no es obvio. La reducción de la interacción superficial limita aún más los pasos de equilibrio entre adsorción y desorción, haciendo que este gradiente no sea suficiente para una separación efectiva. Por lo tanto, todas las proteínas se eluden simultáneamente con un gradiente del 10%. Además, a medida que aumenta el tamaño de las partículas, más proteínas se eluyen al 10%, lo que reduce la elución observada anteriormente en un 30%.

Conclusiones

Referencias