Fermentador de acero inoxidable de laboratorioComo equipo central en el cultivo de microorganismos, la síntesis de metabolitos y la investigación de reacciones biológicas, se utiliza ampliamente en microbiología, bioingeniería, ciencias alimentarias y otros campos con las ventajas de resistencia a la corrosión, fácil limpieza y control preciso de la temperatura. Su estandarización operativa determina directamente la estabilidad del sistema de fermentación y la repetibilidad experimental, mientras que el proceso de esterilización es un requisito previo clave para evitar la contaminación por bacterias diversas y garantizar el éxito del experimento. Este artículo ordenará en detalle el proceso de operación estándar y el método de esterilización central del fermentador de acero inoxidable del laboratorio, y proporcionará a los experimentadores una guía práctica para aterrizar.
I. proceso de operación del fermentador de acero inoxidable de laboratorio
El funcionamiento del fermentador de acero inoxidable de laboratorio debe seguir la lógica de circuito cerrado de "preparación - puesta en marcha - fermentación - cierre", el núcleo es controlar con precisión la temperatura, pH、 Parámetros clave como oxígeno disuelto y agitación para satisfacer las necesidades de crecimiento y metabolismo microbiano.
(1) preparación previa a la operación: construir una base experimental sólida
Inspección del equipo: verificar el Estado de los componentes centrales del fermentador uno por uno: el tanque y los sellos no están dañados ni filtrados; La rotación del remo de mezcla es flexible y sin atascos; Los sensores de temperatura, los Electrodos de ph, los Electrodos de oxígeno disuelto y otras sondas están limpios y sin arañazos; El tubo de admisión, el tubo de llenado, el tubo de escape y otras tuberías son suaves y sin obstrucciones; Las válvulas de seguridad, los medidores de presión y otros componentes de Seguridad están dentro del período de validez de verificación. Al mismo tiempo, verifique si el equipo de apoyo (como compresor de aire, enfriador de agua, bomba peristáltica, olla de esterilización) funciona normalmente.
Preparación de materiales: preparar con precisión el medio de cultivo de acuerdo con la fórmula de fermentación para garantizar que los componentes (fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sal inorgánica, oligoelementos, etc.) se pesen con precisión y se disuelvan completamente para evitar aglomeraciones. Para los componentes fáciles de oxidar o sensibles al calor, deben prepararse por separado y complementarse posteriormente mediante filtración estéril (membrana filtrante de 0,22 micras). Preparar la suspensión de la CEPA para garantizar que la actividad de la CEPA cumpla con los estándares y la concentración cumpla con los requisitos de vacunación.
Conexión y sellado de tuberías: conecte cada tubería de acuerdo con el proceso de fermentación - El tubo de admisión está conectado con el sistema de aire estéril, el tubo de escape está conectado al dispositivo de condensación y al sistema de tratamiento de gases de escape, el tubo de llenado está conectado con una botella de llenado estéril, y el tubo de muestreo Está equipado con una válvula de muestreo estéril. Después de la conexión, apriete las tuercas de la interfaz para garantizar un sellado apretado (que se puede verificar a través de pruebas de presión posteriores) para evitar fugas de aire o invasión de bacterias diversas durante el proceso de fermentación.
(2) puesta en marcha del equipo: configuración precisa de los parámetros
Puesta en marcha sin carga: conecte la fuente de alimentación general del fermentador, active el sistema de control, pruebe el sistema de mezcla a su vez (ajuste la velocidad a 50 - 100 rpm, observe la estabilidad del funcionamiento del remo de mezcla), el sistema de control de temperatura (establezca 37 ° c, verifique si el módulo de calefacción o refrigeración comienza y se detiene normalmente), el sistema de control de pH (calibrar el electrodo de pH con un amortiguador estándar, asegúrese de que el error de lectura sea ≤ ≤ 0,05), el sistema de control de oxígeno disuelto (calibrar el electrodo de oxígeno disuelto, observar si el cambio de lectura es sensible después de
Llenado del medio de cultivo y preestablecimiento de parámetros: el medio de cultivo preparado se inyecta en el fermentador a través de un embudo estéril, y el volumen de llenado se controla en el 50% - 70% del volumen efectivo del tanque (para evitar el desbordamiento de espuma o la falta de oxígeno disuelto durante el proceso de fermentación). Después de cerrar la boca de alimentación, se preestablecen los parámetros centrales en el sistema de control: temperatura (como bacterias 37 ° c, hongos 28 ° c), velocidad de agitación (50 - 300rpm según las necesidades de la cepa), ventilación (generalmente 0,5 - 2vvm, es decir, 0,5 - 2 volúmenes de aire estéril por hora por volumen de medio de cultivo), pH (como bacterias 7,0 - 7,2, levadura 4,5 - 5,5) y estrategia de alimentación (tiempo de alimentación, velocidad de alimentación).
(3) operación de fermentación: monitoreo dinámico y regulación
Operación de vacunación: utilice la tecnología de operación aséptica para la vacunación: limpie y desinfecte la boca de la semilla con alcohol, inyecte rápidamente la suspensión de la CEPA en el tanque después de abrir la boca de vacunación, y apriete la tuerca de la boca de vacunación inmediatamente después de la inyección. El proceso de vacunación debe ser rápido y estandarizado para evitar la introducción de bacterias diversas durante demasiado tiempo de exposición al aire.
Monitoreo y ajuste de parámetros: la temperatura se registra cada hora en la etapa inicial de la fermentación, pH、 Parámetros como el oxígeno disuelto y la velocidad de agitación se pueden extender a 2 - 4 horas para registrar una vez después de la estabilización. Control dinámico de acuerdo con los cambios de parámetros: cuando la temperatura se desvía del valor establecido, se ajusta a través del módulo de calefacción o refrigeración; Añadir amoníaco estéril o solución de NaOH cuando el pH disminuye, y ácido clorhídrico estéril o ácido orgánico cuando el pH aumenta; Cuando el oxígeno disuelto es demasiado bajo, puede aumentar la velocidad de agitación, aumentar la ventilación o introducir oxígeno puro; Cuando aparece una gran cantidad de espuma, agregue manualmente un defoamer estéril o active el sistema automático de defoamer.
Muestreo y detección: muestreo regular de acuerdo con las necesidades experimentales, desinfección alcohólica de la válvula de muestreo antes del muestreo y liberación de una pequeña cantidad de caldo de fermentación para lavar la tubería, y luego recogida de muestras. Las muestras deben detectar oportunamente la concentración de bacterias (como la determinación de od600), el contenido de metabolitos (como el análisis de Cromatografía líquida de alto rendimiento), los componentes residuales del medio de cultivo, etc., para proporcionar una base para el juicio del proceso de fermentación y el ajuste de los parámetros.
(4) final de la fermentación: estandarizar el tiempo de inactividad y la limpieza
Operación de parada: cuando la fermentación alcanza el punto final preestablecido (como el pico de concentración de hongos y la producción máxima de metabolitos), primero apague el módulo de calefacción / refrigeración, el sistema de agitación y el sistema de ventilación, y luego Corte la fuente de alimentación general. Abra lentamente la válvula de escape para descargar la presión, y después de que la presión en el tanque baje a la presión atmosférica, abra la salida de descarga para recoger el caldo de fermentación.
Limpieza preliminar: vaciar el caldo de fermentación residual en el tanque a tiempo, lavar el interior del tanque, el remo de mezcla y la superficie de la sonda con agua del grifo, y eliminar la adherencia bacteriana obvia y los residuos del medio de cultivo. Para el sistema de tuberías, se puede lavar conectando agua del grifo de alta presión para garantizar que no haya acumulación de líquido residual.
2. proceso de esterilización del fermentador de acero inoxidable de laboratorio
La contaminación por bacterias diversas es una de las principales causas del fracaso de los experimentos de fermentación. la esterilización de los fermentadores de acero inoxidable de laboratorio debe seguir el principio de "cobertura completa y matanza completa". el núcleo está esterilizado para tanques, medios de cultivo, tuberías y accesorios. el método común es la esterilización por calor húmedo (esterilización por vapor de alta presión). los escenarios especiales pueden cooperar con la esterilización por calor seco o la esterilización química.
(1) preparación antes de la esterilización: investigación y pretratamiento
Inspección del equipo y la tubería: confirme que el sello del fermentador (como el anillo de sellado de silicona) no está envejecido y que la interfaz de la tubería no está suelta; Compruebe si el nivel del agua de la olla de esterilización cumple con los estándares, y la válvula de Seguridad y la válvula de escape funcionan normalmente. Para los componentes que no son resistentes a altas temperaturas (como algunos electrodos de pH y electrodos de oxígeno disuelto), es necesario retirarlos y reemplazarlos por tapones especiales para esterilización con antelación o adoptar un tratamiento estéril separado.
Pretratamiento del tanque y la tubería: enjuagar el tanque y la tubería con agua desionizada para eliminar el detergente o las impurezas residuales. Después de inyectar el medio de cultivo en el tanque, abra el remo y revuelva durante 5 - 10 minutos para garantizar que el medio de cultivo se distribuya uniformemente y evitar que la aglomeración local afecte el efecto de esterilización.
(2) método básico de esterilización: operación de esterilización húmeda y caliente (común)
La esterilización húmeda y caliente utiliza vapor de alta presión a alta temperatura (121 ° c) y alta humedad para matar microorganismos y esporas, adecuado para tanques, medios de cultivo, tuberías y otros componentes resistentes a altas temperaturas, el proceso específico es el siguiente:
Sellado y admisión de aire: cierre todas las aberturas del fermentador (puerto de alimentación, puerto de muestreo, puerto de salida), apriete las tuercas de cada interfaz y asegúrese de que el tanque esté sellado. Conecte el tubo de escape y el tubo de admisión del fermentador a la olla de esterilización o al generador de vapor de esterilización especial, abra la válvula de admisión, introduzca lentamente el vapor y elimine el aire frío en el tanque y en la tubería (los residuos de aire frío pueden causar una temperatura local insuficiente y una esterilización incompleta).
Aumento de presión y aislamiento térmico: después de que el tubo de escape descargue continuamente vapor uniforme (sin mezcla de aire frío), cierre la válvula de escape y comience a aumentar la presión. Cuando la presión en el tanque sube a 0,1 MPa (presión de metro), la temperatura alcanza los 121 ° c, manteniendo la presión y la temperatura durante 30 - 60 minutos (ajustado de acuerdo con la composición del medio de cultivo: el tiempo de los componentes difíciles de esterilizar, como almidón y proteínas, se extiende a 60 minutos, y el medio de cultivo ordinario Se puede mantener durante 30 minutos). Monitorear de cerca la presión y la temperatura durante el proceso de esterilización, y si la presión disminuye, es necesario reponer el vapor a tiempo.
Presión arterial y enfriamiento: después de la esterilización, primero abra lentamente la válvula de escape para descargar la presión, y cuando la presión baje a 0,02 mpa, abra el sistema de enfriamiento (como el enfriador de agua) para enfriar el tanque. Cuando la temperatura en el tanque cae a 40 - 50 ° c (evitar la inactivación de la CEPA debido a la vacunación excesiva a una temperatura demasiado baja, lo que conduce a la solidificación del medio de cultivo) y la presión cae a la presión atmosférica, apague el sistema de refrigeración y prepárese para la vacunación.
(3) método de esterilización asistida: adaptación a escenarios especiales
Esterilización por calor seco: para los componentes que no pueden ser esterilizados por calor húmedo (como cucharas de muestreo de metal, accesorios en la Mesa de operaciones asépticas), Póngalos en una caja de esterilización por calor seco, esterilizarlos a 160 - 180 ° C durante 2 - 3 horas, y enfriarlos naturalmente a temperatura ambiente para su uso posterior.
Esterilización química: limpiar o remojar las tuberías o superficies que no son resistentes a altas temperaturas (como algunas tuberías de plástico, sondas de sensores) con un 75% de alcohol durante 30 minutos, y luego enjuagar con solución salina estéril para eliminar el alcohol residual para evitar la inhibición de los agentes químicos en las bacterias.
Esterilización del sistema de aire estéril: el aire que entra en el proceso de fermentación debe ser estéril y se puede tratar mediante esterilización a alta temperatura (calentar el aire a 121 ° C durante 30 minutos) o filtración del filtro (utilizando un filtro estéril de 0,22 micras) para garantizar que el aire que entra en el tanque esté libre de bacterias diversas.
(4) verificación y mantenimiento después de la esterilización
Verificación del efecto de esterilización: se puede utilizar el "método de cultivo en blanco" - no se inocula después de la esterilización, el fermentador se cultiva a la temperatura establecida de la fermentación durante 24 - 48 horas, si el medio de cultivo no está turbio y no hay crecimiento bacteriano, significa que la esterilización está calificada; También se pueden utilizar indicadores biológicos (como esporas de bacillus stearothermus), cultivar indicadores después de la esterilización y esterilizar si el indicador no cambia de color.
Restauración y conservación de componentes: después de pasar la esterilización, la sonda retirada con antelación (como ph, electrodos de oxígeno disuelto) se enjuagará con solución salina estéril y se instalará y restaurará para garantizar el sellado de la interfaz. Los fermentadores que no se utilizan inmediatamente deben mantenerse secos, se puede introducir aire estéril para secar el interior y se pueden reservar después de cerrar todas las aberturas.
3. precauciones clave para la operación y esterilización
Prioridad de seguridad: está estrictamente prohibido abrir el tanque o la olla de esterilización sin autorización durante el proceso de esterilización, y es necesario operar lentamente al descargar la presión para evitar la ebullición del medio de cultivo causada por una fuerte caída de presión; Al operar el sistema de mezcla, está prohibido insertar manos o herramientas en el tanque para evitar daños mecánicos.
La operación aséptica recorre todo el proceso: la vacunación, el muestreo, los suplementos y otros enlaces deben llevarse a cabo en la Mesa de operaciones asépticas, y los operadores deben estandarizar el uso de ropa aséptica, guantes y máscaras para evitar la introducción artificial de bacterias diversas.
Mantenimiento regular del equipo: inspección mensual del envejecimiento de los sellos del fermentador y reemplazo oportuno; Calibrar el sensor de temperatura, el electrodo de ph, el electrodo de oxígeno disuelto y el manómetro cada 3 - 6 meses para garantizar la detección precisa de los parámetros; Después de la esterilización, limpie el tanque a tiempo para evitar la corrosión residual de la pared interior de acero inoxidable en el medio de cultivo.
Registro completo de parámetros: registro detallado de la temperatura durante la operación, pH、 Parámetros como el oxígeno disuelto y la velocidad de agitación, así como la presión de esterilización, la temperatura y el tiempo de aislamiento térmico, proporcionan una base para la repetición del experimento y la investigación del problema.
En resumen,Fermentador de acero inoxidable de laboratorioEl proceso de operación y esterilización debe seguir el principio central de "control preciso y garantía estéril". El proceso de operación estandarizado puede garantizar la estabilidad de los parámetros de fermentación y mejorar la repetibilidad del experimento; El estricto proceso de esterilización puede evitar la contaminación por bacterias diversas desde la fuente y garantizar el éxito del experimento. Al dominar los procesos y precauciones anteriores, se puede dar pleno juego al valor experimental del fermentador y proporcionar un apoyo confiable para la investigación microbiana y los experimentos de bioingeniería.