El sv40 humano fue transferido al osteoblasto hfob1.19 (str)

I. transfección de osteoblastos hfob1.19 (str) por sv40 humanoCondiciones de cultivo

En segundo lugar,Tratamiento posterior a la recepción

Métodos de tratamiento celular de reanimación:Llenar el medio de cultivo y sellar la boca del frasco después de cultivarlo en buenas condiciones es la mejor manera de transportar células. Las células recibidas rocían todo con un 75% de alcoholBotellas celulares,Estrictamente estérildespuésColoque el vial celular en una incubadora y deje reposar durante 2 - 4 horas para estabilizar el Estado celular.. después de la reposo, el microscopio observa el crecimiento celular y toma fotos de diferentes múltiplos de las células (preferiblemente 40x, 100x, 200X cada una). las fotos de los tres primeros días son una base importante después de la venta. no se proporciona el Estado predeterminado de recepción de las fotos.

Métodos de tratamiento de células congeladas:Después de recibir la célula, observe si hay hielo seco restante en la Caja de espuma, si el criodepósito está intacto y si hay deshielo. si encuentra que el hielo seco se evapora o el criodepósito está deshielo roto, tome una foto a tiempo y Póngase en contacto con nosotros. Si la célula no se pone en contacto con nosotros dentro de los tres días de la firma, la recepción es buena por defecto. Si hay un problema de actividad en el primer tubo de reanimación, Póngase en contacto con nosotros a tiempo, y los técnicos se comunicarán con usted para guiarlo antes de reanimar el segundo tubo.Los problemas en la recuperación del segundo tubo sin contactar con nosotros no se venderán después de la venta.

Pasos de cultivo celular

a yTransmisión celular: siCuando no se supere el 80% de confluencia, se recogerá el medio embotellado en un tubo centrífuga, se dejará un medio de cultivo de 5 ML y se colocará a 37 ° C y 5% de Co.₂Cultivo en incubadora; Si la densidad celular supera el 80%, se puede realizar el cultivo de paso.

Células adherentesLos pasos son los siguientes:

1) abandonar el sobrenadante de cultivo y lavar las células 1 - 2 veces con PBS sin iones de calcio y magnesio;

2) añadir 1 ml de líquido digestivo (0,25% TRYPSIN - 0,53 mm edta) en el frasco de cultivo, colocarlo en la incubadora para digerir durante 1 minuto, y luego observar la digestión celular bajo el microscopio. si la mayoría de las células se redondean y se caen, llevarlo rápidamente de vuelta a la Mesa de operaciones. después de golpear suavemente el frasco de cultivo Varias veces, añadir 6 ML con 10% de suero.Medio de cultivoTerminar la digestión;

3) soplar suavemente las células, extraerlas en un tubo centrífuga después de caerse, centrifugarlas a 1000 RPM durante 5 - 8 minutos, descartar el sobrenadante, añadir 1 - 2 ml de medio de cultivo y soplarlas bien;

4) añadir el medio de cultivo de 5 - 6 ml por botella y dividir la suspensión celular en una nueva placa de Petri de 6 cm que contiene el medio de cultivo de 5 - 6 ML o en el frasco de cultivo t25 en una proporción de 1: 2.

(es decir, 1 botella de t25 inoculada de generación en generación a 2 botellas de t25 o 2 placas de Petri de 6 cm)

Células suspendidasLos pasos de transmisión son los siguientes:

1. método de semicambio de líquido

Tratamiento de medio cambio de líquido, deje reposar el frasco de cultivo vertical en la incubadora durante aproximadamente una hora, absorba suavemente alrededor de 3 ml del medio de cultivo, y luego reabastezca el medio de cultivo de 3 ML. si el medio de cultivo cambia de color lentamente, puede agregar directamente alrededor de 500 ul fbs. al pasar, puede reabastecer directamente el Medio de cultivo de 5 ML en dos botellas de cultivo. por lo general, de esta manera, alrededor de 3 veces se puede pasar por centrifugación para eliminar las células muertas.

2. método de intercambio de líquido centrífuga

Si es necesario dividir el vial, se puede recoger la suspensión celular en un tubo centrífuga de 1000 rpm, centrifugar durante 5 minutos, descartar el sobrenadante, reponer 1 - 2 ml de medio de cultivo y volver a mezclar, y luego dividir la suspensión celular en el nuevo vial t25 en una proporción de 1: 2, añadir 6 - 8 ml de nuevo medio de cultivo configurado de acuerdo con los requisitos de las instrucciones para mantener la vitalidad del crecimiento celular, y la transmisión posterior se lleva a cabo en una proporción de 1: 2 a 1: 5 de acuerdo con la situación real.

b yCriopreservación celular:

1. cuando las células crezcan hasta cubrir el 80% del área del frasco de cultivo, abandone el medio de cultivo en el frasco de cultivo t25 y limpie las células con PBS una vez;

2. agregue alrededor de 1 ml de líquido digestivo al 0,25% al frasco de cultivo, observe bajo un microscopio invertido, agregue 5 ml de líquido de cultivo para terminar la digestión después de que la célula se reduzca y redondee, luego sople suavemente la célula para que se desprenda, y luego transfiera la suspensión a un tubo centrífuga de 15 ml, centrifugado a 1000 RPM durante 5 minutos;

3. deseche el suero superior, agregue 1 ml de Criopreservación libre de suero biológico Yagi (número de artículo: c7001) a las células precipitadas y mezcle bien y agregue al criopreservación.

4. basta con poner las células congeladas directamente en el refrigerador a - 80 ° c. si las células deben transferirse al tanque de nitrógeno líquido en el período posterior, entoncesSe necesita un refrigerador a - 80 ℃.centroAlmacenamiento durante más de 24 horasLuego se transfiere al tanque de nitrógeno líquido.

C yReanimación celular:

1. retire el criodepósito celular del nitrógeno líquido (preste atención a usar protección)Mascarilla), colocarla rápidamente Descongelar en un baño de agua a 37 ° C hasta que no haya cristalización en el congelador, y luego limpiar la pared exterior del congelador con alcohol al 75%;

2,Trasladar las células del criodepósito a En un tubo centrífuga de 15 ml de medio de cultivo de 5 ml, 1000 RPM se centrifuga durante 5 minutos;

3,Desechar la parte superior de la limpieza, precipitar y suspender con un medio de cultivo de 5 ml, inocularAl frasco de cultivo t25, coloqueA 37 ° c, 5% Co₂Cultivo en una caja de cultivo celular;

4. al día siguiente, cambie por un medio de cultivo fresco para continuar el cultivo.

Precauciones:Algunas células no se adhieren firmemente a la pared y son propensas a caerse durante el transporte, lo cual es normal. Si se separa más, se puede recoger todo el medio de cultivo del frasco de cultivo en un tubo centrífuga, que se centrifuga a 1000 RPM durante 5 minutos.Recoger shangqingHacer cultivo de transición(cultivo comparativo posterior)Se añade 1 - 2 ml de precipitación, se sopla suavemente, se vuelve a colgar, y después de digerir 1 - 2 minutos, se añade 5 ml de medio de cultivo para detener la reacción. Centrifugar de nuevo, descartar la parte superior y agregar 1 - 2 ml de medio de cultivo para suspender. A continuación, se realiza el paso por botella (dos t25) en una proporción de 1: 2, se completa el nuevo medio de cultivo a 5 - 8 ml / botella y finalmente se coloca37 ℃, 5% CO₂Cultivo en una caja de cultivo celular.

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