(servicio experimental) PCR cuantitativo fluorescente en tiempo real

1. Resumen de los servicios

(servicio experimental) PCR cuantitativo fluorescente en tiempo real(quantum real - time pcr, qpcr) se refiere al método de agregar grupos fluorescentes al sistema de reacción de amplificación pcr, utilizar la acumulación de señales fluorescentes para monitorear todo el proceso PCR en tiempo real, y finalmente analizar cuantitativamente plantillas desconocidas a través de la curva estándar. Como tecnología "estándar de oro" en la investigación de biología molecular, qpcr se ha convertido en una herramienta para el análisis de expresión genética, la detección de patógenos y la investigación de variantes genéticas debido a su sensibilidad, especificidad y precisión.

Confiamos en la Plataforma de detección PCR para proporcionarExtracción de ácido nucleico de la muestra, transcripción inversa, amplificación qpcr al análisis de datosServicio técnico de ventanilla única. Ya sea que necesite detectar niveles de expresión de arnm, mirna, lncrna o realizar análisis de variación del número de copias de ADN (cnv), podemos proporcionarle datos de alta calidad que cumplan con los estándares.

2. principios y métodos técnicos

Ofrecemos dos estrategias de detección convencionales para satisfacer diferentes necesidades experimentales:

• Método de tinte sybr Green i:

• Principio:Los tintes sypr Green I pueden unirse específicamente a pequeñas zanjas de ADN de doble cadena, y la señal de fluorescencia aumenta después de la unión. Con el aumento de los productos pcr, la señal fluorescente aumenta simultáneamente.

• Aplicable:Detección preliminar de diferencias de expresión genética, detección de muestras a gran escala, proyectos sensibles a costos. Cooperamos con el análisis de la curva de fusión (melt curve) para garantizar la uniformidad de los productos amplificados.

• Método de sonda taqman:

• Principio:Se utilizan sondas específicas diseñadas para la secuencia objetivo (grupos de notificación de fluorescencia marcados en 5 'extremos y grupos de extinción marcados en 3' extremos). Cuando la sonda está completa, no hay fluorescencia, y la acción hidrolítica de la enzima Taq durante el proceso de amplificación corta el Grupo fluorescente y emite fluorescencia.

• Aplicable:Alta especificidad requiere experimentación, detección PCR múltiple, clasificación de snp, detección de muestras traza.

3. contenido del servicio y todo el proceso

Seguimos estrictamente los procedimientos operativos estandarizados (sop) para garantizar la precisión y el control de cada paso:

Fase 1: diseño experimental y optimización

• Diseño del primer / sonda:Diseñar Primers Trans - intron para el gen objetivo (target gene) para evitar la interferencia de la contaminación del ADN genómico; Cribado de genes de ginseng interno (housekeeping gene, como gapdh, actb, 18s rrna, etc.).

• Verificación preexperimental:La especificidad del primer se verificó a través de PCR ordinario y gel de agarosa para optimizar la temperatura de recocido.

Fase 2: procesamiento de muestras

• Extracción de ácidos nucleicos:Para diferentes tipos de muestras (células, tejidos, sangre, secreción, etc.), se utilizan kits especiales para extraer ARN o ADN total de alta calidad para la detección de concentración y pureza (od260 / 280) y la evaluación de la integridad.

• Transcripción inversa (síntesis de adnc):Uso de oligo (dt) o primer aleatorio para arnm; El uso de Primers de anillo de tallo o métodos de cola para mirnas garantiza una eficiencia de transcripción inversa uniforme.

Fase 3: pruebas a bordo

• Construcción del sistema:Configure el sistema de reacción qpcr de alta fidelidad y establezca al menos tres repeticiones técnicas para eliminar el error de adición de muestras.

• El programa funciona:Las señales fluorescentes se recogen en tiempo real y se generan curvas de amplificación.

Fase 4: análisis de datos

• Cuantificación relativa:Adopción2- sí.ΔΔCtSe calculó la diferencia de expresión génica entre el grupo experimental y el grupo control por el método Fold change.

  
  

• Cuantitativo:Construir un estándar de plásmido, dibujar una curva estándar y calcular el número exacto de copias del gen objetivo en la muestra.

  
  

4. nuestras ventajas centrales

1. Plataforma de hardware:El PCR cuantitativo convencional tiene una diferencia mínima entre los agujeros y una alta estabilidad de los datos.

2. Sistema estricto de control de calidad:Seguir internacional MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments） Guía. Monitorear estrictamente la eficiencia de amplificación (90% - 110%) y la relación lineal (rm2 > 0,99) para eliminar falsos positivos / falsos negativos.

3. Procesamiento de muestras complejas:Tiene una rica experiencia en el tratamiento de secciones de ffpe, tejidos traza, exocrinos y muestras de sangre entera, eliminando eficazmente los inhibidores de la pcr.

4. Entrega de datos profesionales:No solo proporciona el valor CT original, sino que también proporciona el gráfico de expansión, el gráfico de fusión, el gráfico de columna de expresión relativa / gráfico térmico, y genera un informe completo que contiene materiales y métodos experimentales detallados, que cumple directamente con los requisitos de publicación de sci.

5. escenarios de aplicación

• Análisis del nivel de expresión genética:Verificación de expresión diferencial de arnm, lncrna, ARN circular bajo diferentes condiciones de tratamiento o modelos de enfermedad (verificación qpcr después de ARN - seq).

• Detección de mirna:Estudio sobre la regulación de la expresión del mirna.

• Variación del número de copias de ADN (cnv):Detección de amplificación o ausencia de genes tumorales e identificación del número de copias transgénicas.

• Verificación de clasificación snp:Identificación del genotipo del sitio polimórfico de un solo nucleótido.

• Detección de microorganismos patógenos:Determinación de la carga viral y análisis cualitativo y cuantitativo de bacterias.

• ChIP-qPCR:Verificación del enriquecimiento de fragmentos de ADN después de la Inmunoprecipitación de la cromatina para estudiar la interacción proteína - adn.

6. requisitos y estándares de entrega de muestras

• Sugerencias para la entrega de muestras:

• Células: Precipitación celular]

• 1 * 10 + 6， El PBS se congela rápidamente después de la limpieza.

• Organización:Tejido animal > 50 mg, tejido vegetal > 100 mg, congelación rápida de nitrógeno líquido o conservación de rnalate

• Sangre:Toda la sangre necesita tratamiento anticoagulante o suministro directo de suero / plasma separados.

• ARN y ADN:Concentración > 50 ng / μl, cantidad total > 1 μg, transporte de hielo seco.

• Contenido de la entrega:Informe experimental completo (incluidos los pasos experimentales, la información del reactivo), archivo de datos original (.des /.xls), gráfico de resultados del análisis de datos (tabla Estadística de Microsoft e imágenes de alta definición).