PC - 12 diferenciación de células de feocromocitoma suprarenal de rata

PC - 12 diferenciación de células de feocromocitoma suprarenal de rata

PC - 12 diferenciación de células de feocromocitoma suprarenal de rataEs una línea celular de crecimiento adherente derivada del feocromocitoma medular de la rata, que se puede diferenciar en células nerviosas bajo la acción de factores específicos debido a sus características únicas de diferenciación inducida, conservando al mismo tiempo la función de secreción de neurotransmisores, convirtiéndose en un modelo in vitro clásico para el estudio del neurodesarrollo, la transmisión de señales neuronales y la reparación de lesiones neuromusculares, proporcionando un vector experimental clave para la investigación básica en neurociencia y la transformación clínica de enfermedades neurodegenerativas.

I. características biológicas básicas

I) la fuente se asocia con el tipo de célula

Esta línea celular aísla el tejido de feocromocitoma medular de la glándulas suprarrenales de ratas adultas. las células de feocromocitoma tienen naturalmente la capacidad de sintetizar y secretar neurotransmisores catecolaminas (como la adenosina de noradrenalina y la dopamina), que son altamente similares a las células neuroendocrinas del sistema nervioso simpático. Las células PC - 12 presentan una forma epidémica en estado indiferenciada, que tiene la capacidad de proliferación infinita de las células tumorales y las características básicas de las células neuroendocrinas; En condiciones inducidas, puede diferenciarse en células nerviosas, formar neuritas y tener parte de la estructura y función de las neuronas, convirtiéndose en un modelo único para conectar la investigación de células tumorales con células nerviosas.

(2) características morfológicas y diferenciadas

En estado indiferenciado, las células son poligonosas o elípticas, se concentran densamente cuando crecen las paredes adheridas, las células están estrechamente conectadas entre sí, el Citosol contiene una pequeña cantidad de partículas basófilas (partículas de almacenamiento de neurotransmisores), el núcleo es circular, el núcleo es obvio, la cromatina se distribuye uniformemente, la capacidad de proliferación es fuerte y el tiempo de duplicación es de aproximadamente 48 - 72 horas.

Después de la diferenciación inducida, la morfología celular cambió significativamente: bajo la acción de factores como el factor de crecimiento nervioso (ngf), las neuritas delgadas (de hasta 5 - 10 veces el diámetro de la célula) comenzaron a extenderse en 24 - 48 horas, y algunas de las neuritas formaron ramas y se conectaron entre sí, mostrando una morfología neurogénica típica; Las partículas basófilas en el Citosol aumentan y la expresión de enzimas relacionadas con la síntesis de neurotransmisores (como la tirosina hidroxilasa) se eleva, al tiempo que se expresan marcadores específicos de neuronas (como la proteína neurofilament NF - 200, la proteína relacionada con microtubulos map2), pero se conservan algunas características celulares de feocromocitoma (como la secreción de catecolamina), formando un fenotipo único de "neuroides".

(3) características moleculares y funcionales

A nivel molecular, las células PC - 12 tienen las características moleculares centrales relacionadas con los nervios: expresan los receptores del factor de crecimiento nervioso (trka, p75ntr) en estado indiferenciado, proporcionando una base molecular para la diferenciación inducida; Después de la diferenciación, la expresión de los genes clave de la vía de síntesis de neurotransmisores (tirosina hidroxilasa th, dopamina beta - hidroxilasa dbh) se aumentó significativamente, y la secreción de adenosina y dopamina de demershen aumentó 3 - 5 veces en comparación con el Estado indiferenciado, que se puede detectar mediante Cromatografía líquida de alto rendimiento (clar); Al mismo tiempo, las proteínas relacionadas con la transmisión de señales neuronales (como la proteína vesical sináptica sv2 y la sinapsis i) están reguladas al alza, lo que tiene cierta capacidad de formación de estructuras sinápticas y puede simular la función de transmisión de señales de las neuronas.

Funcionalmente, las células PC - 12 diferenciadas son sensibles a sustancias neurotóxicas (como 6 - hidroxidopamina, proteína amiloide beta), y después de la exposición, aparecen manifestaciones de daño como la contracción de la Neurita Wei y la apoptosis celular, que son altamente consistentes con el proceso patológico del daño neuronal y pueden usarse para el estudio de la patogénesis del daño nervioso.

2. condiciones de cultivo y diferenciación in vitro

(1) condiciones básicas de formación

Selección prioritaria de medios básicosusarMedio de cultivo rpmi - 1640Añadir 10% de suero equino, 5% de suero bovino fetal (la combinación de suero doble puede mantener la capacidad de proliferación celular y el Estado indiferenciado) y 1% de reactivos antibacterianos (para prevenir la contaminación bacteriana). El entorno de cultivo debe mantener estrictamente 37 ° c, 5% de CO2 y 95% de humedad, la concentración de CO2 no fluctúa más de ± 0,5%, el pH se controla en 7,2 - 7,4 y la presión osmótica es de 280 - 320mosm / kg; Una temperatura demasiado alta (> 39 ° c) puede causar un aumento de la tasa de apoptosis celular, que requiere el monitoreo de los parámetros ambientales en tiempo real a través de sensores de incubadora.

(2) operación de diferenciación inducida

Los factores de inducción comunes sonFactor de crecimiento nervioso (ngf)Los pasos específicos son los siguientes:

Además, se pueden utilizar otros factores inductores (como los factores neurotróficos derivados del cerebro bdnf, forskolin), pero la diferenciación inducida por ngf es la más repetida y es un esquema de diferenciación común en zui.

Iii) congelación y recuperación

En el momento de la criopreservación, se utilizó el medio de cultivo rpmi - 1640 que contenía 10% de Dimetilsulfóxido (dmso), 20% de suero bovino fetal y 10% de suero equino como criopreservación, y la concentración de células indiferenciadas se ajustó a 1 × 10 ⁶ - 2 × 10 ⁶cells / ML (las células diferenciadas son fácilmente dañadas debido a las neuritas, no Se recomienda la criopreservación). después de la separación, se utilizó el método de enfriamiento gradiente: se colocó a 4 ° C durante 30 minutos - 20 ° C durante la noche para la conservación a largo plazo del nitrógeno líquido.

En el momento de la reanimación, Se descongela rápidamente el criodepósito en un baño de agua a 37 ° C durante 1 - 2 minutos, se diluye inmediatamente con un medio de cultivo básico precalentado de 10 veces el volumen, se centrifuga 1000 × G durante 5 minutos para eliminar Dmso y se inocula en el frasco de cultivo después de la suspensión pesada. La tasa de supervivencia de la reanimación suele alcanzar más del 75%. Después de la reanimación, es necesario cultivar 2 - 3 generaciones, y luego inducir la diferenciación después de que la morfología celular se estabilice para evitar que el estrés de reanimación afecte la eficiencia de la diferenciación.

III. principales escenarios de aplicación experimental

(1) estudio sobre el mecanismo de neurodesarrollo y diferenciación

Las células PC - 12 son el modelo central del estudio de la diferenciación neuronal: los factores neurotróficos pueden analizar los mecanismos moleculares que regulan la diferenciación celular detectando la activación de las vías de señalización trka (como las vías pi3k / akt y RAS / mapk) durante la inducción de ngf; Utilizar técnicas de interferencia genética (como la eliminación del gen trka por sirna), observar la formación de neuroblastos celulares y los cambios en la expresión de marcadores neuronales, y verificar el efecto regulador de los genes clave en la diferenciación; Además, se puede estudiar el efecto de las modificaciones epigenéticas (como la metilación del adn, la Acetilación de la histona) en la expresión de genes relacionados con la diferenciación neuronal (como th, map2) y explorar redes de regulación epigénica en el desarrollo nervioso.

(2) construcción de modelos y mecanismos de enfermedades neurodegenerativas

Apoyándose en la sensibilidad de las células diferenciadas a las sustancias neurotóxicas, se pueden construir varios modelos in vitro de enfermedades neurodegenerativas:

A través de estos modelos, se pueden seleccionar posibles fármacos neuroprotectores, como antioxidantes y antiinflamatorios, para evaluar su efecto reparador en el daño celular.

(3) reparación de lesiones neurológicas y detección de medicamentos neurotróficos

En el estudio de reparación de daño nervioso, se puede utilizar el modelo de diferenciación celular PC - 12 para evaluar la actividad de los fármacos neurotróficos: cocultivar los fármacos candidatos (como bdnf, neurojie glucosídeos) con células diferenciadas, observar la longitud y el número de ramas de las neuritas a través de un microscopio, detectar los niveles de expresión de marcadores neuronales (como map2) y evaluar el efecto promotor de los fármacos en el crecimiento de las neuritas; En modelos de daño nervioso in vitro (como hipoxia, daño inducido por estrés oxidativo), se administra un pronóstico de Administración de medicamentos secos, se detecta la tasa de supervivencia celular, la liberación de Lactato deshidrogenasa (ldh) (que refleja el grado de daño celular), se verifica el efecto neuroprotector del medicamento y se proporciona una base para el desarrollo de medicamentos para el tratamiento clínico de daño nervioso.

IV. precauciones para la aplicación experimental