Kit de cultivo de organoides (cáncer de hígado, colon, riñón)

Método de uso

1. la generación original
(1) los tejidos después de la extracción deben colocarse en una botella de muestreo de líquido de conservación de tejidos preenfriado (2 - 8 ° c) e, transferirse rápidamente a un laboratorio limpio para el tratamiento de tejidos y la separación celular, tomar fotos y registrar la información.
(2) prepare varias placas de Petri y agregue el tampón de cultivo primario b preconfriado a 4 ℃ para su reserva.
(3) desinfectar el frasco de muestreo, poner el tejido en una placa de petri, limpiar tres veces con el tampón de cultivo primario b, cortar el tejido Jian en aproximadamente 1 - 3 mm en volumen con Jian oftalmológico o Dao quirúrgico3Bloque de tejido.
(4) el tejido utiliza el tejido primario del cáncer de mama humano para digerir la digestión Ye c, la digestión volátil a 37 ° C durante 10 - 20 minutos, (la digestión se observa en cualquier momento durante el proceso digestivo).
(5) tomar una pequeña cantidad de líquido para observar bajo un microscopio, después de observar más células individuales o racimos celulares por debajo de 70um bajo el microscopio, agregar un triple volumen de tampón de cultivo primario b Para terminar la digestión.
(6) filtrar con una pantalla de 100 um de diámetro, recoger el lixiviado, eliminarlo y limpiarlo después de enriquecer 300g en centrifugación durante 5 minutos, y añadir el amortiguador de cultivo original B para volver a suspender la centrifugación.
(7) cálculo del pegamento de matriz: observar el volumen de tejido recogido después del paso 6, añadir 25 veces el pegamento de matriz del volumen de tejido..abs9495) paneles de pavimentación de suspensión pesada.
(8) como ejemplo, la placa de cultivo celular de 24 agujeros, cada agujero con una mezcla de pegamento de matriz de tejido de 25 ul, se pavimenta (se opera a 4 ° c).
(9) coloque la placa de cultivo colocada en una caja de cultivo a 37 ° C durante 10 - 15 minutos para formar pegamento, y agregue el medio de cultivo de órganos similares al cáncer de mama humano a (restaurar la temperatura ambiente) para el cultivo.
2. cultivo de organoides
(1) la pistola de pipeta absorbe el medio de cultivo y añade 1 - 2 ml de tampón de cultivo de órganos de 4 ° C G a cada agujero para colocarlo durante 2 minutos.
(2) la pistola de pipeta sopla suavemente el pegamento de matriz, se recoge en un tubo centrífuga de 15 ML y se deja reposar a 4 ° C durante 10 minutos. (un Grupo por cada 6 - 8 agujeros)
(3) a: el número de organoides es insuficiente o el volumen es pequeño: centrifugar 5 min para descartar el líquido superior, añadir una cantidad adecuada de tampón de cultivo de organoides G para suspender en un tubo centrífuga de 1,5 ml, 300g de centrifugación 5 min para descartar el líquido para el paso 4.
B: cuando el número de organoides es mayor o el volumen es mayor: 5 min de centrifugación se abandona en el sobrenadante, se agrega una cantidad adecuada de líquido digestivo D para la digestión de organoides durante 2 - 3 min, se agrega un tampón de cultivo G para la digestión final, 5 min de centrifugación se abandona en la mezcla, se agrega una cantidad adecuada de líquido amortiguador de cultivo G para la suspensión pesada en un tubo centrífuga de 1,5 ml, y 300 g de líquido para la eliminación centrífuga de organoides durante 5 min para el paso 4.
(4) después de la recolección de órganos similares, se añade pegamento estromal para la suspensión pesada, 25 ul pegamento estromal por agujero se extiende en una placa de cultivo celular de 24 agujeros, y se coloca en una incubadora durante 10 - 15 minutos para agregar 500 ul de medio de cultivo de órganos similares al cáncer de mama humano A.
3. Criopreservación de organoides
(1) la pistola de pipeta absorbe el medio de cultivo y añade 1 - 2 ml de tampón de cultivo de órganos de 4 ° C G a cada agujero para colocarlo durante 2 minutos.
(2) la pistola de pipeta sopla suavemente el pegamento de matriz, se recoge en un tubo centrífuga de 15 ML y se deja reposar a 4 ° C durante 10 minutos. (un Grupo por cada 6 - 8 agujeros)
(3) centrifugar 5 min para descartar el líquido superior, añadir una cantidad adecuada de tampón de cultivo de organoides G para volver a suspender, y 300g centrifugar 5 min para descartar el líquido.
(4) añadir una cantidad adecuada de líquido criogénico de organoides f, soplar suavemente y colgar fuertemente, tomando como ejemplo la placa de cultivo celular de 24 agujeros: la densidad es de 2 agujeros y congelar 1 tubo, y el volumen de cada tubo es de 1,4 ML.
(5) haga un buen trabajo de información de marcado, después de enfriar el programa, mueva al nitrógeno líquido para su conservación a largo plazo.
4. reanimación de organoides
(1) tomar 10 ml de tampón de cultivo de órganos similares g en un tubo centrífuga de 15 ML.
(2) extraer las células organoides congeladas del tanque de nitrógeno líquido y colocarlas rápidamente en una olla de baño de agua a 37 ° C para derretirlas.
(3) durante el proceso de deshielo en el baño de agua, es necesario sacudir suavemente el tubo de congelación para garantizar que el liofilizado se derrita en 1 - 2 minutos.
(4) transferir rápidamente las células similares a los órganos disueltas a un tubo centrífuga de 15 ml, soplar suavemente 6 - 8 veces con un tubo de pipeta, centrifugar 300g durante 5 minutos, y luego eliminar el sobrenadante y recoger la precipitación de las células similares a los órganos. Añadir una cantidad adecuada de tampón de cultivo de organoides G para la suspensión pesada en un tubo centrífuga de 1,5 ml de 300g para la centrifugación durante 5 minutos.
(5) el pegamento de matriz cuelga pesadamente, 25 ul de pegamento de matriz por agujero se extiende en una placa de cultivo celular de 24 agujeros, se coloca en una incubadora durante 10 - 15 minutos y se añade 500 ul de medio de cultivo de órganos similares al cáncer de mama humano A.