Histobright, un tinte fluorescente con estructura tisular local

Tintes fluorescentes que permiten la visualización de la estructura tisular local

HistoBright

Histobright es un pigmento fluorescente de teñido de membrana de respuesta ambiental que puede lograr la excitación de dos fotones. tiene una excelente permeabilidad tisular y puede cambiar las propiedades fluorescentes de acuerdo con la estructura local del tejido, por lo que puede lograr una visualización de tejido de alto contraste. En combinación con el tratamiento de transparencia del tejido y el uso del microscopio láser de dos fotones, se puede realizar una observación en profundidad y un análisis de la estructura espacial del bloque de tejido.

¿※ sí?Este producto se basa en los resultados de la investigación de la Universidad de kochi y la Universidad de Ehime y es producido y vendido por Funakoshi (planta).

¿※ sí?Este producto es solo para investigación y no está disponible para fines distintos de la investigación.

Histebright es un tinte fluorescente sensible al medio ambiente que muestra una amplia gama de longitudes de onda en función de la polaridad del disolvente. Cuando se aplica a un tejido transparente, la fluorescencia cambia en respuesta al microambiente dentro del tejido, y luego se combina con la doble luz.El microscopio láser hijo puede observar claramente la estructura tisular.

◆ métodos tradicionales de análisis de la estructura organizativa y nuevos análisis de la estructura organizativa tridimensional

El análisis tradicional de la estructura tisular se realiza mediante el teñido de tejidos con tintes de color, como el método de teñido sumulina - Yihong (he). El uso de estos tintes de color es difícil de teñir los bloques de tejido en bloques enteros, generalmente se necesita hacer una rebanada delgada antes de observar. Sin embargo, las rebanadas delgadas pueden perder fácilmente la información tridimensional de la estructura tisular, por lo que es necesario preparar un gran número de rebanadas para reproducir la estructura tridimensional.

Histobright es un nuevo tinte fluorescente sensible al medio ambiente (el compuesto en la tesis original se llama pc) sintetizado por el Dr. renziyangfu, del Departamento de investigación educativa de la Universidad de kochi. actualmente, el Dr. kenzhi kimura, el Dr. Masaki Murakami y el Dr. Ryosuke kawakami, del Departamento de Medicina de la Universidad de ehime, promueven el desarrollo de tintes fluorescentes aplicados a estructuras organizativas tridimensionales. Histebright se acumula en la Biopelícula y, dependiendo del entorno local, la fluorescenciaLuz verde~.luz del infrarrojo cercanoCambios a gran escala. Por lo tanto, cuando histobright se aplica a tejidos biológicos, puede inducir cambios en los tonos fluorescentes en función de la estructura del tejido, logrando así una observación de alto contraste de la estructura del tejido. Debido a que histobright es capaz de realizar la excitación de dos fotones, además del Microscopio confocal láser, también se puede utilizar el microscopio láser de dos fotones para la observación. Además, con el tratamiento de transparencia del tejido (además del método de mantener la estructura de la membrana para la operación de desengrasamiento), el uso de histobright permite observar muestras de tejido grueso sin destruir la estructura del tejido (sin preparar rebanadas delgadas) y realizar imágenes en profundidad a través de un microscopio láser de dos fotones para realizar el análisis estructural tridimensional del tejido.

◆ características

● reactivos de teñido de membrana de respuesta ambiental, que se pueden mostrar de acuerdo con el entorno circundanteLuz verde~.luz del infrarrojo cercanoPropiedades fluorescentes de. Al distinguir el rango de longitud de onda de fluorescencia que necesita ser detectado, se puede lograr una unión tisular local de alto contraste.

Visualización de la estructura.

●Junto con el tratamiento de transparencia de tejidos sin desengrasar (como rapiclear (sunjin Lab company), lucid, etc.), se puede lograr un análisis tridimensional profundo de la estructura organizativa.

●※ el uso de surfactantes (triton X - 100, tween 20, etc.) disuelve las membranas lipídicas en los tejidos y puede tener un impacto en la Tinción de histobright, por lo que no se recomienda su uso. Si es necesario usarlo, discuta las condiciones aplicables.

●Se puede observar con un Microscopio confocal láser (luminiscencia recomendada: láser de 488 nm) o un microscopio láser de dos fotones (luminiscencia recomendada: láser de 960 nm).

●Cuando se observa con un microscopio láser de dos fotones, se puede observar la fibra de colágeno en el tejido no teñido mientras se utiliza este reactivo con imágenes de generación de armónicos secundarios (shg).

●Después de teñir y observar con histobright, se puede teñir con HE.

◆ texto original

Inoue, K.,et al., J. Mater. Química.B.,10(10), 1641～1649 (2022). Síntesis y propiedades fotofísicas de un nuevo tinte pirénico push-pull con emisión verde a rojo lejano y su aplicación a la imagen de tejidos celulares y cutáneos humanos. [PMID:35194628[en inglés]

◆ principios

Espectro de excitación / emisión

Histebright es un tinte fluorescente sensible a la polaridad del disolvente (solvatocromic flowersent dye) que cambia las propiedades de fluorescencia en función de la polaridad molecular del disolvente. Según la Polar del disolvente, la fluorescenciaverdeDirección (baja polar)luz del infrarrojo cercano(alta polar) cambios sustanciales en el rango.

Cambios en el espectro de fluorescencia en el modelo de membrana lipídica

Histobright muestra una alta afinidad por las membranas lipídicas y muestra diferentes características de fluorescencia en función de la fase de las membranas lipídicas. A diferencia de los valores máximos de fluorescencia en los lípidos del modelo lo de fase ordenada (esfingomielina (sm) / bilis - sólido - alcohol (chol), la longitud máxima de onda en los lípidos del modelo LD de fase desordenada (duplc) también se transfirió a un rango de longitud de onda larga de unos 30 nm, y el rendimiento cuántico de fluorescencia también disminuyó de 0,72 (sm / chol) a 0,37 (duplc).

Los datos espectrales de fluorescencia anteriores fueron proporcionados por el Dr. renziyangfu de la Universidad de kochi.

◆ datos de aplicación

Imagen del tejido normal de la piel humana transparente con un microscopio láser de dos fotones

Después de fijar el bloque de tejido cutáneo normal humano con un 4% de paraformaldehíde / pbs, se preparó una Sección de 500 micras, mientras que se realizó un tratamiento de transparencia de tejido (lucid) de 76 H y una Tinción de histobright (10 micras). A través del microscopio láser de dos fotones, los bloques de tejido se estimulan con láser a 960 nm, a 492 nm (shg:azul）、500-550 nm（verde）、560~593nm（naranja) y 593 - 690 nmrojo) se obtienen imágenes fluorescentes y se hacen las siguientes cuatro imágenes sintéticas.

※ 492 nm（azul) proviene de la señal SHG de la fibra de colágeno en el tejido, no de la señal fluorescente de origen histebright.

A continuación, se utiliza un microscopio láser de dos fotones para tomar imágenes de 500 micras consecutivas a intervalos de 5 micras en la dirección del eje z, y se utiliza un software de análisis de imágenes para la construcción tridimensional para visualizar la estructura fina del tejido cutáneo humano de una manera tridimensional.

Imagen tridimensional del tejido normal de la piel humana transparente con un microscopio láser de dos fotones

Después de fijar el bloque de tejido de la piel humana normal con un 4% de paraformaldehíde / pbs, se preparó un corte de 1 mm, mientras que se realizó un tratamiento de transparencia de tejido de 72 H (rapiclear, sunjin Lab company) *, Tinción histórica (10 μm) y Tinción nuclear (hoechst33342). A través del microscopio láser de dos fotones, los bloques de tejido fueron estimulados por láser a 1100 nm, a menos de 492 nm (shg:azul）、500~550 nm（verde）、560~593 nm（naranja) y 593 - 690 nmrojo) se obtienen imágenes fluorescentes y se hacen las siguientes cuatro imágenes sintéticas. Sobre la base de las condiciones anteriores, se toma continuamente a un intervalo de 5 micras en la dirección del eje z, y se utiliza el software de análisis de imágenes para la construcción tridimensional, animando los datos continuos.

* Después de la fijación del bloque de tejido en este experimento, no se realizó el tratamiento de película transparente, y el tratamiento de transparencia directa y el teñido.

Para el video completo, consulte: labchem.fujifilm - wako.com.cn / product / show / 1646.htm

Repetir para el teñido he

Teñir con histobright y observar bloques de tejido de células cutáneas normales humanas, colocarlos tranquilamente en PBS y eliminar los reactivos de transparencia. Luego se prepara en rodajas delgadas y se tiñe con HE. Después de que se ha confirmado la tinción histobright, todavía se puede realizar una Tinción he clara.

Observación y teñido bajo Microscopio confocal láser y microscopio láser de dos fotones

Después de fijar el bloque de tejido cutáneo normal humano con un 4% de paraformaldehíde / pbs, se preparó una Sección de 0,5 mm, mientras que se realizó un tratamiento de transparencia de tejido de 72 horas (rapiclear, sunjin Lab company) * e histobright (10 micras). Posteriormente, se observaron con un Microscopio confocal láser (izquierda: láser de 488 nm de luz estimulada) y un microscopio láser de dos fotones (derecha: láser de 960 nm de luz estimulada). Aunque las dos imágenes no son significativamente diferentes, la señal SHG (fibra de colágeno) estimulada por dos fotones se puede observar bajo un microscopio láser de dos fotones.

* Después de la fijación del bloque de tejido en este experimento, no se realizó el tratamiento de película transparente, y el tratamiento de transparencia directa y el teñido.

Los datos de imagen anteriores son proporcionados por el Dr. Ryosuke Kawakami de la Universidad de ehime.

◆ lista de productos