Leica laser confocal Microscopy

El Microscopio confocal láser TCS sp8 dls Leica combina las ventajas de dos sistemas de imágenes en uno: con Leica TCS sp8 dls (placa de luz digital), puede utilizar una iluminación suave de un solo plano en el microscopio para lograr el confocal. Al desarrollar el reflector twinlight, podemos convertir la Plataforma de enfoque común Leica TCS sp8 en un microscopio de luz multifuncional simple y fácil de usar.

El Microscopio confocal láser Leica (como Leica sp8 y la serie stellaris) es un sistema de imágenes tridimensionales de alta resolución ampliamente utilizado en biomedicina, Ciencias de materiales y otros campos. Su operación debe combinarse con la óptica, el control láser y la tecnología de procesamiento de imágenes. la siguiente es una guía de operación detallada:

I. preparación previa a la operación

1. inspección del medio ambiente y el equipo

Requisitos ambientales:

Cámara Oscura independiente o ambiente sombreado para evitar que la luz externa interfiera con la señal fluorescente.

La temperatura se controla en 20 - 25 ° C y la humedad es ≤ 60%, evitando la condensación de la lente o fallas en el circuito.

Inspección del equipo:

Se confirma que el indicador de Estado del láser (por ejemplo, 405 nm, 488 nm, 561 nm, 633 nm) es normal (el Verde está listo).

Compruebe si la lente objetivo (como la lente de aceite 10x / 0.3, 20x / 0.75, 63x / 1.4) está limpia y si la Plataforma de carga se mueve sin problemas.

Abra el sistema de enfriamiento (como el enfriador de agua láser) para asegurarse de que la temperatura se estabilice en el valor establecido (generalmente 18 - 22 grados celsius).

2. preparación de muestras

Muestras biológicas:

Las células vivas deben cultivarse en placas de Petri especiales de enfoque común (como LAB - Tek ii) para evitar dificultades de enfoque causadas por el uso de diapositivas comunes.

Las rebanadas de tejido fijo deben sellarse con un agente de sellado de endurecimiento antifluoro (como prolong gold), con un espesor ≤ 20 micras.

Muestras de materiales:

Las muestras no transparentes deben pulirse hasta que la rugosidad de la superficie ra sea inferior a 0,1 micras, y las muestras transparentes (como los polímeros) deben evitar interferencias fluorescentes espontáneas.

Requisitos de marcado:

Los tintes fluorescentes deben coincidir con la longitud de onda láser (por ejemplo, dapi se estimula a 405 nm y Alexa Flower 488 a 488 nm).

Al marcar multicolor, asegúrese de que el espectro de emisión del tinte no se superponga (la señal se puede separar a través de la función de resolución espectral).

II. procesos operativos básicos

1. encendido e iniciación

Orden de inicio:

Encender la fuente de alimentación general → 2. Activar el sistema de enfriamiento láser → 3. Abrir el cuerpo principal del microscopio → 4. Inicie el software de control (como las X o Stellaris suite).

Autoexamen de software:

El software detecta automáticamente el láser, la cabeza de escaneo, la Plataforma de carga y otros módulos, y confirma que el Estado es "listo".

Ejecutar la función "daily check" para calibrar el camino óptico y detectar la sensibilidad del sistema (como la ganancia pmt, la Potencia láser).

2. posicionamiento y enfoque de la muestra

Vista previa del espejo de baja potencia:

Seleccione el espejo de aire 10x, apague el láser y localice rápidamente el área de la muestra con luz transmitida, como una lámpara halógeno.

Se mueve a la posición de destino a través de la perilla XY de la estación de carga o la función de navegación del software.

Enfoque común:

Encienda el láser de 488 nm (baja potencia, como el 5%) y elija el modo "live" para observar en tiempo real.

Ajuste el motor de paso del eje Z y use la herramienta "fine focus" para enfocarse gradualmente hasta que la señal fluorescente sea Fuerte.

Al cambiar el objetivo de alta potencia (como la lente de aceite 63x), es necesario añadir una inmersión especial (como el aceite tipo f) entre el objetivo y la lámina de vidrio de la tapa.

3. configuración de los parámetros de adquisición de imágenes

Potencia láser y ganancia pmt:

Potencia láser: aumenta gradualmente a partir del 1%, evitando el fotoblanqueamiento (generalmente no más del 20%).

Ganancia pmt: ajustar a una intensidad de señal entre 100 - 800 (imagen de 12 bits) para evitar la saturación (> 4095).

Parámetros de escaneo:

Resolución: elija 512 × 512 (vista previa rápida) o 2048 × 2048 (imagen de alta precisión) según sea necesario.

Velocidad de escaneo: número promedio de líneas 1 - 4 veces (aumento cuando el ruido es alto) y número promedio de cuadros 1 - 8 veces (disminución cuando la imagen dinámica de células vivas).

Tamaño del agujero de la aguja: generalmente se establece en 1 unidad de aire (au), equilibrando la resolución con la relación señal - ruido.

Configuración espectral:

Al marcar multicolor, se escanea el espectro de emisión de la muestra en modo "lambda scan" y se establece un rango de longitud de onda (por ejemplo, dapi: 410 - 480 nm, Alexa Flower 488: 500 - 550 nm).

4. imágenes tridimensionales y series temporales

Apilamiento del eje z:

Estableciendo la posición de Inicio / final y el paso del paso (por ejemplo, 0,5 micras), el software toma automáticamente imágenes de varias capas y sintetiza modelos 3D.

Serie temporal:

Al tomar imágenes de células vivas, se establece un intervalo de tiempo (por ejemplo, 1 fotograma cada 30 segundos) y el número total de fotogramas (por ejemplo, 100 fotogramas) para registrar el proceso dinámico.

Activar la función "autofocus" para mantener el foco estable y evitar el desfocalización causado por el Movimiento celular.

3. aplicación de la función del Microscopio confocal láser Leica

1. modo de iluminación de la hoja de luz

Imagen rápida de baja fototoxicidad adecuada para muestras gruesas (como embriones de pez cebra).

Pasos de operación:

Cambie al módulo de luz y ajuste el espesor de la luz de iluminación (generalmente 2 - 5 micras).

Configurar la adquisición simultánea de doble cámara (como la luz transmitida y la señal fluorescente).

Las imágenes multiángulos se empalman a través de la función "multi - vista" para reconstruir la estructura tridimensional.

2. imágenes de superresolución (como sted)

Rompiendo el límite de refracción, la resolución alcanza los 20 - 50 nm.

Puntos clave de la operación:

Utilice un objetivo sted especial (como la lente de aceite 100x / 1.4) y un láser de depletión (como 592 nm).

Ajustar la Potencia láser de depletión (generalmente 50 - 200 mw) y el modo de máscara de fase (como 2d o 3D sted).

Después de la recolección, se utiliza el software "huygens" o "thunder" para el procesamiento de deconvolución.

3. resolución espectral y deconvolución lineal

Separación de señales superpuestas al marcar multicolor:

Se obtiene la biblioteca espectral de emisión de la muestra en modo "lambda scan".

Los datos espectrales se cargan en la herramienta "spectral unmixing", y el software calcula automáticamente la señal pura de cada canal.

Ajustar el umbral para eliminar el ruido de fondo y guardar la imagen dividida.

IV. mantenimiento y mantenimiento

1. limpieza diaria

Elementos ópticos:

Retire el polvo de la superficie de la lente objetivo y el filtro con un globo soplado, y prohíba limpiar directamente con hisopos de algodón o toallas de papel.

Si es necesario limpiar, sumerja una pequeña cantidad de etanol (o líquido de limpieza especial) en papel de lente y limpie ligeramente en espiral.

Plataforma de carga y almacén de muestras:

Limpie con un paño antiestático para evitar la inmersión residual en aceite o el sellador.

2. mantenimiento láser

Restricciones de uso:

Trabajar continuamente durante no más de 8 horas para evitar el sobrecalentamiento y el daño del tubo láser.

Al apagar, primero reduzca la Potencia láser al 1%, y luego apague el interruptor láser.

Monitoreo de la vida útil:

Vea la vida útil restante en la interfaz del software "estado laser" (por ejemplo, el láser de 488 nm suele ser ≥ 20000 horas).

Cerca del final de la vida útil, Póngase en contacto con Leica con antelación para reemplazar el tubo láser.

3. calibración periódica

Calibración del camino óptico:

Calibrar trimestralmente el eje óptico y la alineación del agujero de la aguja con microesferas fluorescentes estándar, como tetraspeck.

Calibración mecánica:

Comprobar anualmente la precisión del eje XY / Z de la Plataforma de carga (el error debe ser inferior a 0,1 micras) y ajustar los parámetros del motor de paso si es necesario.

V. solución de problemas comunes

Imagen sin señal

Compruebe si el láser está encendido, si la ganancia PMT es superior a 0 y si el filtro coincide (por ejemplo, el filtro de emisión no bloquea la señal).

Imagen inexistente

Confirme si la inmersión de la lente es suficiente, si el agujero de la aguja está desviado y si la muestra es plana (por ejemplo, las protuberancias de células vivas causan desfocalización).

Inestabilidad de la Potencia láser

Limpie la ventana de salida del láser y verifique si la temperatura del agua del sistema de enfriamiento está en el rango establecido (como ± 0,5 ° c).

Software Cardon

Cierre otros programas grandes, reduzca la resolución de la imagen o la velocidad de escaneo, o aumente la memoria del ordenador (se recomienda ≥ 32 gb).

6. precauciones de seguridad del Microscopio confocal láser Leica

Seguridad láser:

Use gafas protectoras láser durante la operación (la longitud de onda debe cubrir todos los cables láser utilizados).

Está prohibido mirar directamente a los rayos láser o reflejar la luz, evitando que la piel esté expuesta a láseres de alta potencia durante mucho tiempo (por ejemplo, > 50 mw).

Bioseguridad:

Al manipular células vivas o patógenos, se opera en un Gabinete de bioseguridad para evitar la contaminación de las muestras.

Seguridad química:

Al limpiar con un disolvente orgánico, como el etanol, operar en un Gabinete de ventilación para evitar la inhalación de gases volátiles.