Reactivos biológicos

I,Kit de detección de micoplasmaCaracterísticas del producto:

(1) solo se necesita 1 μl de líquido sobrenadante celular de cultivo y 1 olla de baño de agua, no se necesita extraer ADN genómico, no se necesitan equipos experimentales complejos como microscopía fluorescente, pcr, analizador de gel, imagero de gel y detector de bioluminiscencia;

(2) solo se necesitan 1h para producir resultados, un método de detección simple, rápido y sensible de micoplasma celular;

(3) solo se necesita una operación de un solo paso para completar todo el experimento, y los resultados experimentales son intuitivos y fáciles de distinguir a simple vista de acuerdo con los cambios de color del líquido de reacción, sin necesidad de gel, evitando el riesgo de falsos positivos causados por la apertura de la tapa en varios pasos;

(4) la sensibilidad es mucho mayor que la del método PCR y puede detectar una variedad de micoplasmas comunes en el Cultivo celular (micoplasma nasal porcino, micoplasma de amoníaco jing, micoplasma oral, micoplasma libre de colesterol lai, micoplasma fermentado, micoplasma salival, micoplasma humano, micoplasma de pera, lo que representa el 98% de la contaminación por micoplasma).

En segundo lugar,Kit de detección de micoplasmaComposición (25t):

3. pasos experimentales:

(1) preparación del líquido de cultivo celular a medir

Las células a medir toman más de 200 μl de volumen de medio de cultivo celular cuando se cultivan durante 2 - 3 días y el grado de fusión es preferiblemente superior al 80%, se centrifugan durante 5 minutos de acuerdo con 200 g, y luego se toma el líquido sobrenadante para la detección posterior (no se puede tomar el medio de cultivo de 50 μl en el Fondo del tubo y la precipitación celular);

(2) preparación del sistema de reacción (primero, la solución a, la solución b, el control positivo, el aceite de parafina Se descongela y se derrite y se coloca sobre hielo)

Retire la solución a de - 20 ℃, y después de descongelarla y derretirla, invierta suavemente arriba y abajo para mezclar bien. De acuerdo con el número de muestras de células a medir, se prepara el siguiente sistema de reacción en un tubo microcentral (el proceso de preparación del sistema de reacción es muy importante en el hielo);

Nota: cada experimento requiere un control negativo, un control positivo y debido al error de pipeta, la detección de n muestras generalmente recomienda la preparación de N + 3 sistemas de reacción anteriores.

Mezcle suavemente con un resonador y luego Envuélvelo en un tubo PCR (se recomienda usar un tubo PCR de 200 μl de volumen), y cada tubo Envuélvelo en 24 μl de líquido de reacción después de la mezcla anterior;

(3) muestra (es muy importante mantener el hielo durante todo el proceso de muestra, especialmente el aceite de parafina cubierto por encima del líquido de reacción necesita preconfriamiento en hielo)

Muestra a medir: añadir 1 μl de líquido de cultivo a la tubería de reacción después de la centrifugación a medir, y luego usar esta pistola de adición de líquido para moverse hacia arriba y hacia abajo para soplar suavemente 5 veces;

Control negativo: no añadir ninguna muestra ni 1 μl de agua estéril;

Control positivo: añadir 1 μl de muestra de control positivo, y luego usar esta pistola de adición de líquido para moverse hacia arriba y hacia abajo y soplar suavemente 5 veces;

A continuación, agregue suavemente 25 μl de aceite de cera de piedra (reaccionando en una olla de baño de agua) por encima de la solución de cada tubo de reacción para evitar que la evaporación del líquido provoque resultados inexactos. Al agregar aceite de parafina, preste atención a cambiar la cabeza de la pistola cada vez para evitar la contaminación cruzada entre las muestras. Si la reacción se realiza en un pcr, no es necesario agregar aceite de parafina.

(4) reacción

Establecer la temperatura de la olla de baño de agua o el PCR en 61 ° c, colocarlo en el tubo de reacción e incubarlo durante 60 minutos;

Nota:

1. la temperatura real de la olla de baño de agua puede desviarse de la temperatura establecida, se recomienda calibrar primero con un termómetro. De hecho, la reacción de 59 - 63 ° C se puede llevar a cabo, pero afectará la sensibilidad de la detección;

2. los productos de reacción no se pueden abrir, de lo contrario los aerosoles producidos provocarán la aparición de falsos positivos en las pruebas posteriores. Se recomienda envolver el tubo de reacción en una bolsa de plástico o guantes, descartarlo en un bote de basura especial y limpiarlo a tiempo;

3. no se recomienda el uso de hornos o baños metálicos para la reacción de calentamiento;

(5) juicio de resultados

Después de 60 minutos de reacción a 61 ° c, se extrae inmediatamente el tubo de reacción y se coloca a temperatura ambiente. Observar los resultados de la reacción en un ambiente bien iluminado (se recomienda ambientar en papel blanco). Si el líquido de reacción sigue siendo azul y morado, se determina que es negativo; Si el líquido de reacción es azul cielo, se determina que es positivo.

IV. documentación pertinente

1, ShiyuHe, YanzhiHuang, YanlingZhao. AReverseTranscription-PolymeraseSpiralReaction(RT-PSR)-BasedRapidCoxsackievirusA16DetectionMethodandItsApplicationintheClinicalDiagnosisofHand,Foot,andMouthDisease. FrontiersinMicrobiology.2020; 12(11):734-743.

2, Audrey Jean, Florencia Tardy, Omran Allatif. Evaluación de la contaminación por micoplasma de cultivos celulares mediante PCR de qPCR en un par de cebadores de satofuniversal que se enfoca en un fragmento de 1,5 kb de genes de ARN16 Srs. PLOSONE.2017; 12(2):e0172358.

3、ZohreSoheily, MohammadSoleimani, Keivan Majidzadeh-Ardebili. Detección de contaminación por micoplasma de cultivo celular mediante método de amplificación isotérmica mediada por loop. CellJ.2019; 21(1):43-48.

4, XinXu, XueyuWang, WenHu. Análisis de reacción espiral de enlace cruzado de polimerasa mejorado para diagnóstico rápido del parvovirus2 canino. FrontiersinVeterinaryScience.2020; 7(57):1629-1636.