Columna de Cromatografía líquida

Columna de Cromatografía líquida

El sistema del Cromatógrafo Líquido consta de varias partes, como depósito, bomba, muestreador, columna cromatográfica, detector y grabadora. La fase móvil en el depósito es bombeada al sistema por una bomba de alta presión, la solución de la muestra entra en la fase móvil a través del muestreador y se carga en la columna de cromatografía (fase fija). debido a que los componentes de la solución de la muestra tienen diferentes coeficientes de distribución en las dos fases, cuando se hacen movimientos relativos en las dos fases, después de repetidos procesos de distribución de adsorción y desorción, los componentes generan grandes diferencias en la velocidad de movimiento, se separan en un solo componente y salen de la columna a su vez. al pasar por el detector, la concentración de la muestra se convierte en una señal eléctrica y se transfiere al registrador, y los datos se imprimen en forma de mapa.

Estructura del principio

[1] estructura de la columna de cromatografía líquida:

a 、 La columna vacía está formada por el montaje de la Unión de la columna, el tubo de la columna y el filtro.

La Unión de la columna adopta una estructura de bajo volumen muerto. la Unión de la columna es un componente roscado en ambos extremos, con un extremo de 7 / 16 pulgadas de hilo interno y el otro extremo de 3 / 16 pulgadas de hilo interno (estandarizado en el país y en el extranjero). El hilo interior de 7 / 16 pulgadas está conectado a un tubo de columna de 1 / 4 pulgadas (Φ6,35 mm), y se coloca un anillo de presión en el medio para sellar. El hilo interior de 3 / 16 pulgadas está conectado a un tubo de conexión de 1 / 16 pulgadas (0 1,57 mm), y el anillo de presión también se coloca en el Centro para el sellado de la conexión de la columna. Para minimizar el volumen muerto fuera de la columna, al instalar la columna cromatográfica, inserte el tubo de conexión de Phi 1,57 mm hasta el final después de presionar el anillo a través del tornillo hueco, y luego apriete el tornillo hueco. Después de que el anillo de presión es exprimido y deformado por un tornillo hueco, se aprieta en el tubo de conexión (la longitud del tubo expuesto después de que el tubo de conexión pase por el anillo de presión debe controlarse estrictamente en 2. 5 mm de largo u otras dimensiones fijas).

En las juntas de la columna en ambos extremos, se coloca un filtro de acero inoxidable (o filtro) en ambos extremos del tubo de la columna para bloquear la pérdida del relleno de la columna sin ser expulsado de la columna por la fase móvil. Cada componente de la columna vacía está hecho de acero inoxidable 316l, que puede soportar la acción general del disolvente. Sin embargo, debido a que los disolventes que contienen cloruros son corrosivos para ellos, se debe tener cuidado al usarlos, tales disolventes no pueden permanecer en columnas y tuberías de conexión durante mucho tiempo para evitar la corrosión.

b 、 Relleno de columnas:

La separación de las columnas de Cromatografía líquida se realiza entre el relleno y la fase móvil, y la clasificación de las columnas depende del tipo de relleno. Columna de fase positiva: la mayoría de ellos están llenos de silicona. Según la apariencia, se puede dividir en dos tipos: estereotipado y esférico, y su diámetro de partícula está dentro del rango de 3 - 10 micras. Otro tipo de relleno positivo es el grupo funcional de unión superficial de silicona - cn, - nh2, es decir, el llamado silicona de unión. Columna de fase inversa: rellenos no polares con silicona como matriz, Unidos a grupos funcionales de dieciocho alquilo (ods) en su superficie. También hay formas estereotipadas y esféricas.

Otros rellenos de fase inversa comúnmente utilizados son c8, c4, c2, benceno, etc., con un tamaño de partícula entre 3 y 10 micras. Requisitos para rellenos

Los rellenos de columnas cromatográficas comunes son silicona unida químicamente. Los sistemas de cromatografía de fase inversa utilizan rellenos no polares, que se utilizan comúnmente como silicona de enlace de Silano de dieciocho alquilos, y también se utilizan silicona de enlace de Silano de octilo y otros tipos de silicona de enlace de Silano (como Silano de enlace Ciano y Silano de enlace de aminoácidos). El sistema de cromatografía de fase positiva utiliza rellenos polares, y los rellenos comunes son silicona. El sistema de cromatografía de intercambio de iones utiliza rellenos de intercambio de iones; El sistema de cromatografía de exclusión Molecular utiliza rellenos como geles o microesferas porosas de polímeros; La separación de los enantiómeros suele utilizar rellenos quirales.

Las propiedades del relleno (como la forma del portador, el tamaño de las partículas, el tamaño del poro, la superficie, la cobertura de la superficie del Grupo de unión, el contenido de carbono y el tipo de unión, etc.) y el relleno de la columna cromatográfica afectan directamente el comportamiento de retención y el efecto de separación de la muestra de prueba. Los rellenos con poros inferiores a 15 nm (1 nm = 10) son adecuados para analizar compuestos con un peso molecular inferior a 2.000, mientras que los compuestos con un peso molecular superior a 2.000 deben seleccionar rellenos con poros superiores a 30 nm. A menos que se especifique lo contrario, el tamaño de las partículas de relleno de la columna de análisis es generalmente

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Entre 3 micras y 10 micras. Los rellenos con un tamaño de partícula más pequeño (unos 2 micras) se utilizan a menudo para llenar columnas de microdiámetro (unos 2 mm de diámetro interior), y cuando se utilizan columnas de microdiámetro, el rendimiento de la bomba de infusión, el volumen de inyección, el volumen de la piscina de detección y el volumen muerto del sistema deben coincidir con ellas; Si es necesario, las condiciones de la cromatografía también deben ajustarse adecuadamente. En caso de controversia sobre los resultados de su determinación, prevalecerán los resultados de la determinación de las condiciones cromatográficas especificadas en el texto de la variedad.

Requisitos de temperatura

La temperatura de uso de la fase fija de unión ordinaria con silicona como soporte generalmente no supera los 35 ° c. para mejorar el efecto de separación, la temperatura de uso de la columna cromatográfica se puede aumentar adecuadamente, pero no más de 60 ° c.

Requisitos para la fase móvil

El pH de la fase móvil debe controlarse entre 2 y 8. Cuando el pH es superior a 8, se puede disolver el silicona portador; Cuando el pH es inferior a 2, la fase de unión química conectada al silicona es fácil de hidrolizar y desprenderse. Cuando sea necesario utilizar una fase móvil con un pH superior a 8 en el sistema de cromatografía, se deben seleccionar rellenos resistentes a los álcalis, como rellenos de silicona Unidos con silicona de alta pureza como portador y una alta cobertura de superficie, rellenos de polímeros recubiertos, rellenos híbridos orgánicos - inorgánicos o rellenos no de silicona, etc. Cuando se requiera el uso de una fase móvil con un pH inferior a 2, se deben seleccionar rellenos resistentes al ácido, como rellenos de silicona Unidos por diisopropil o diisobutil que tengan cadenas laterales masivas que puedan producir un efecto protector de bloqueo espacial, o rellenos híbridos orgánicos - inorgánicos, etc.

Precauciones

Eficacia de la columna y columna protectora de la columna

Al obtener una nueva columna, asegúrese de ver la descripción de su funcionamiento primero, luego medir el efecto de la columna, detectar el efecto de la columna regularmente, conservar el mapa de color obtenido en la nueva columna y registrar las condiciones, y detectar regularmente el ensanchamiento de la banda espectral del instrumento. Si se utiliza para el monitoreo en línea, la columna debe proporcionar protección física y química en línea, como la instalación de filtros en línea, columnas de protección de relleno propio y columnas de protección preinstaladas. La función del filtro en línea es evitar que las partículas se acumulen en la cabeza de la columna, la ventaja es que básicamente no afecta la eficiencia de la columna, que se utiliza comúnmente cuando se necesita una alta eficiencia de la columna, y el consumible que se reemplaza con frecuencia es la función del filtro y la columna protectora de la arandela Para evitar la contaminación química de la columna. La desventaja es que la mayoría de las columnas protectoras afectan la eficiencia de las columnas cromatográficas, especialmente cuando se utilizan microcolumnas, las columnas protectoras de relleno propio ordinario se utilizan comúnmente. Algunas de las columnas de protección recién llegadas, como la columna de protección s e n t r y - G u a R d, se caracterizan por una alta calidad, un relleno eficiente, un aumento de la eficiencia de la columna de análisis y una gran capacidad de carga sobre muestras sucias, lo que puede prolongar la vida útil de la columna de protección, uniones apretables a mano, herramientas innecesarias en la instalación, ahorro de tiempo, diseño de núcleo intercambiable, puede utilizar una variedad de rellenos diferentes, principalmente para muestras muy sucias y muy complejas, como muestras bioquímicas, muestras ambientales y alimentos, o no quiere hacer demasiada extracción de fase de vivero, no quiere reducir el efecto de la columna, etc.

Limpieza de columnas cromatográficas

Las muestras hechas deben tener una comprensión completa, limpiarse con una fase móvil con una fuerte capacidad de elución Zui de la muestra, para las columnas de silicona, primero se eliminan las impurezas polares con metanol, luego se activan sucesivamente con Diclorometano seco y n - Heptano 10 - 20 o ral, para las columnas de unión y fase, generalmente se enjuagan a su vez con metanol y agua, cada columna de cromatografía tiene un método de limpieza específico, debe ver sus instrucciones de uso.

Almacenamiento de columnas cromatográficas

Eliminar las impurezas y la sal antes del almacenamiento, utilizar un disolvente de almacenamiento adecuado, evitar el secado de la cama de la columna cromatográfica, evitar la vibración mecánica, evitar el crecimiento de bacterias y prestar atención a la temperatura de almacenamiento.

Resolución de problemas

1. la presión de la columna es demasiado alta

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Puede ser un bloqueo de partículas. La expansión del lecho de la columna, la adsorción irreversible, el crecimiento de bacterias, etc. También puede tratarse de problemas de contrapresión del sistema, como el bloqueo de amortiguadores, el bloqueo de inyectores de muestras, el bloqueo de tuberías o conexiones. Los filtros en línea no están limpios, los sensores de presión no son precisos, etc.

2. baja eficiencia de la columna

Puede ser causado por la contaminación de la columna, el bloqueo parcial del filtro y el volumen muerto en la columna, como el valor p h de la fase móvil o la composición inadecuada de la fase fija. Los cambios drásticos en la fase móvil causan daños físicos a la fase fija, las vibraciones mecánicas causan grietas en la fase fija y la cama de la columna se contrae o se seca.

También puede ser un problema de conexión del instrumento, comprobar cuidadosamente si el muestreador, el detector, la tubería, la columna protectora y el filtro en línea están bien conectados, o puede ser que la columna cromatográfica no esté bien equilibrada y la cantidad de muestra sea demasiado grande.

3. poca repetibilidad, sin picos y baja tasa de recuperación

Puede ser que la columna está contaminada, el valor p h de la fase móvil no es adecuado o la composición no es adecuada, lo que resulta en la pérdida de la fase fija, diferentes disolventes de la muestra o la inestabilidad de la propia muestra, la polar de la fase fija es demasiado fuerte o la polar de la fase móvil es demasiado débil. O se produce una adsorción no específica. También es posible que el tiempo de equilibrio sea insuficiente en el experimento de gradiente, las fluctuaciones de temperatura, los cambios en la composición de la fase móvil, los diferentes disolventes de la muestra, la estabilidad de la muestra no es buena, el desarrollo del método no es bueno, el pH del amortiguador no es adecuado o la capacidad de amortiguación es insuficiente.

Hasta que no haya burbujas en la tubería (desde la botella de disolvente hasta la entrada de la bomba), cambie el canal para continuar purge hasta que no haya burbujas en todos los canales a usar.

10. haga clic en el icono de pump, aparezca el menú de configuración de parámetros, haga clic en la opción de control de pump, seleccione off, haga clic en ok para apagar la bomba y cierre purge valve.

11. haga clic en el icono de pump, aparezca el menú de configuración de parámetros, haga clic en la opción Setup pump, ingrese a la pantalla de Edición de Pump y establezca flujo: 1.0ml / min.

12. haga clic en el icono de la botella debajo de la bomba, como se muestra en la imagen (tomando como ejemplo la bomba binaria), introduzca el volumen real del disolvente y el volumen de la botella. También se puede introducir el volumen de la bomba de parada. Haga clic en ok