El híbrido molecular es el equipo central utilizado en la investigación de biología molecular para la detección de ácidos nucleicos (adn / arn) o proteínas, y es ampliamente utilizado en análisis de expresión genética, detección de mutaciones y otros campos. Su operación debe seguir estrictamente el proceso estandarizado para garantizar la precisión del experimento. Los siguientes son el proceso de uso completo y los puntos clave:
I. preparación previa al experimento
1. preparación de muestras y sondas
Extraer ácidos nucleicos objetivo (como ADN genómico, arnm) de acuerdo con el propósito experimental y transferirlos a soportes sólidos (membrana de nylon / membrana pvdf) después de la extracción enzimática y la separación por electrolisis.
- sonda de etiquetado: la sonda de oligonucleótido específica debe ser etiquetada por isótopo (m2 p), tinte fluorescente o biotina, y es necesario verificar la pureza y concentración de la sonda.
2. inspección de instrumentos
- confirmar que el sistema de control de temperatura del híbrido es normal, la función de la mecedora es estable y el anillo de Goma sellado no está envejecido ni roto.
- precalentar el instrumento con antelación a la temperatura establecida (generalmente 42 - 65 ° c, dependiendo del tipo de sonda), reduciendo el impacto de las fluctuaciones de temperatura en la eficiencia híbrida.
3. configuración del reactivo
Preparar líquidos prehíbridos (incluyendo ADN de esencia de salmón, SDS y otros selladores), líquidos híbridos y líquidos de lavado de concentración de sal gradiente, prestando atención a la filtración y esterilización para evitar la contaminación.
II. pasos operativos básicos
1. prehibridación
- poner la membrana que fija el ácido nucleico a medir en el tubo híbrido, añadir una cantidad suficiente de líquido prehíbrido para sumergir la membrana e incubar a la temperatura establecida durante 1 - 2 horas. Este paso tiene como objetivo cerrar los sitios de unión no específicos en la membrana y reducir el ruido de fondo.
- * control clave *: mantener oscilaciones leves para promover la circulación de líquidos y evitar la generación de burbujas.
2. respuesta híbrida
- descartar el prehíbrido y añadir directamente el híbrido que contiene la sonda marcada (la concentración final de la sonda es generalmente de 1 - 10 ng / ml) y continuar la incubación oscilante suave durante la noche (8 - 16 horas).
- * Estrategia de optimización *: temperatura híbrida = valor TM - 5 ℃ (tm es la temperatura de resolución de cadena de la sonda), teniendo en cuenta la especificidad y sensibilidad.
3. clasificación de la película de lavado
- limpiar en secciones con un detergente con una concentración de sal decreciente por secuencia (por ejemplo, 2 × SSC → 0,5 × SSC → 0,1 × ssc) y eliminar gradualmente las sondas sin Unión o desajuste.
- * habilidades de operación *: absorber el líquido residual antes de cada cambio de líquido, el lavado de alto rigor puede mejorar la especificidad, pero el lavado excesivo puede causar la pérdida de señal real.
3. detección de señales y análisis de datos
1. adquisición de imágenes
Seleccionar el método de detección correspondiente de acuerdo con el tipo de etiqueta de la sonda: el autodesarrollo radiactivo requiere una radiografía presionada; El método de Quimioluminiscencia utiliza un imagero cc; La sonda fluorescente se puede escanear directamente.
- * control de exposición *: ajuste el tiempo de exposición para evitar la saturación, establezca el control en blanco simultáneamente para eliminar la interferencia de fondo.
2. interpretación de los resultados
El análisis cuantitativo utiliza el software imagej para calcular el valor gris de la banda y evaluar semicuantitativamente el nivel de expresión genética; El análisis cualitativo se centra en la coherencia entre la posición de la banda y el peso molecular esperado.
- * manejo anormal *: si aparecen bandas no específicas, es necesario reoptimizar el diseño de la sonda o mejorar el rigor del lavado.
IV. tratamiento y mantenimiento posteriores
1. eliminación de residuos
Los residuos líquidos que contienen isótopos se tratan de acuerdo con las especificaciones de residuos radiactivos y los reactivos de fluorescencia / Quimioluminiscencia se reciclan en contenedores especiales.
2. mantenimiento de instrumentos
Vaciar el líquido en el tubo híbrido, remojar y desinfectar con etanol al 70% después de enjuagar con agua limpia y calibrar regularmente el sensor de temperatura.
Registrar los parámetros de este experimento (temperatura, velocidad, tiempo) en el registro del equipo para la referencia de experimentos posteriores.
El funcionamiento del híbrido Molecular requiere un control preciso de la temperatura, el tiempo y el entorno de la solución, y cualquier desviación de enlace puede conducir a resultados falsos positivos / falsos negativos. Se recomienda que los usuarios iniciales realicen experimentos controlados paralelos y determinen las mejores condiciones de hibridación a través de experimentos previos. Las operaciones estandarizadas y las estrictas medidas de control de calidad pueden garantizar la fiabilidad de los resultados experimentales.