Resumen

La tecnología de electrotransformación de la retina viva en ratones recién nacidos proporciona un medio clave para el desarrollo de la retina y la investigación de enfermedades. El estudio optimiza los parámetros de electrotransformación, realiza la entrega y expresión eficientes de genes exógenos en la retina de ratones recién nacidos con la ayuda del medidor de electroperforación de Onda cuadrada weinid Gene pulse 830, mejora significativamente la eficiencia de la transfección y proporciona una plataforma técnica confiable para la investigación básica relacionada con la retina y la medicina traslacional.

Introducción

Como tejido clave para la transmisión de señales visuales, la investigación sobre el mecanismo de desarrollo y el mecanismo de aparición de enfermedades de la retina siempre ha sido un foco en el campo oftalmológico. La retina del ratón recién nacido se encuentra en una etapa de rápido desarrollo, en la que la manipulación genética puede estudiar eficazmente el papel de los genes en la diferenciación, migración y establecimiento funcional de las células de la retina. Sin embargo, los métodos tradicionales de entrega genética tienen problemas como la baja eficiencia y el gran daño celular en la operación de la retina viva, lo que dificulta satisfacer las necesidades de investigación científica precisa.

La tecnología de electrotransformación cambia instantáneamente la permeabilidad de la membrana celular a través de campos eléctricos pulsados, permitiendo que moléculas grandes como ácidos nucleicos exógenos entren en la célula, mostrando ventajas en la entrega genética de tejidos vivos. Con su avanzada tecnología de pulso de onda cuadrada, sistema de monitoreo inteligente y configuración flexible de parámetros, El medidor de electroperforación de Onda cuadrada weinide Gene pulse 830 proporciona una solución eficiente y precisa para la electrotransformación viva de la retina de ratones recién nacidos y ayuda a los investigadores científicos a romper los cuellos de botella de la tecnología tradicional.

Materiales y métodos

1. animales de experimentación

Ratones recién nacidos c57bl / 6j 0 - 2 días después del nacimiento (p0 - p2), proporcionados por la casa de animales SPF de este laboratorio, con temperatura ambiente de cría (22 ± 2) ºc, humedad del 50% - 60%, ciclo de luz / oscuridad a las 12 horas.

2. reactivos principales

ADN plasmídico (que contiene el gen objetivo gfp, construido por este laboratorio), un reactivo (para la preparación de amortiguadores electroconvertidos, que contienen nacl, kcl, glucosa y otros componentes, con un pH ajustado a 7,4), anestésico (oflurano, para anestesia en ratones), desinfectante (75% etanol).

3. instrumentos principales

Weinid Gene pulse 830 electroperforador de onda cuadrada, microscopio estereoscópico (una marca, para observación de operaciones quirúrgicas), aguja de microinyección (diámetro exterior de 10 - 15 micras, para inyección de plasmídeo), placa de calentamiento termostático (para mantener la temperatura corporal del ratón).

Pasos experimentales

1. anestesia y fijación en ratones

Los ratones recién nacidos se colocaron en una caja de anestesia que contenía oflurano y se transfirieron a una placa de calentamiento a temperatura constante después de inducir la anestesia para mantener la temperatura corporal estable. Fije suavemente la cabeza y las extremidades del ratón con cinta adhesiva para garantizar la estabilidad de la posición corporal del ratón durante la cirugía.

2. localización de la retina e inyección de plasmídeos

Bajo el microscopio estereoscópico, se absorbe el ADN plasmídico que contiene el gen objetivo con una aguja de muestra de microinyección (concentración de 1 - 2 μg / μl), se introduce la aguja desde el borde corneal temporal del globo ocular del ratón, se inserta lentamente la punta de la aguja en la cavidad vítrea, se evita el cristalino y se inyecta con precisión La solución plasmídica de 5 - 10 μl en la cavidad subretiniana. Preste atención a controlar la profundidad y velocidad de la inyección durante la inyección para evitar dañar el tejido de la retina.

3. configuración y operación de parámetros de perforación eléctrica

El medidor de electroperforación de Onda cuadrada weinide Gene pulse 830 utiliza un sistema de optimización preprogramado. de acuerdo con las características del tejido retiniano del ratón recién nacido, se selecciona el modo de transferencia de células de mamíferos y se llaman los parámetros recomendados de las células retinianas incorporadas: pulso de onda cuadrada, el voltaje se ajusta de acuerdo con la edad del ratón y el tamaño del globo ocular (generalmente 50 - 80v), la duración del pulso es de 10 - 20ms, el número de pulsos es de 3 - 5 veces y el intervalo de pulso es de 1 - 2s.

Sujetar suavemente el globo ocular del ratón con un electrodo personalizado en forma de pinzas (la distancia entre los electrodos es de 1 - 2 mm, la superficie está aislada para evitar fugas de corriente eléctrica) para garantizar que el electrodo se ajuste estrechamente a la superficie del globo ocular y no comprima el globo ocular. El programa de perforación eléctrica se inicia a través del interruptor del pie, y la pantalla táctil de 10 pulgadas del instrumento muestra la forma de onda del pulso y la dinámica de los parámetros en tiempo real, lo que facilita al experimentador monitorear todo el proceso. Durante la electroperforación, el instrumento realiza automáticamente una detección inteligente de resistencia, un prepulso mide la resistencia de la muestra y ajusta dinámicamente los parámetros para garantizar que las condiciones de cada descarga eléctrica coincidan con el Estado de las células de la retina. Al mismo tiempo, la tecnología de protección del arco y conversión de polos elimina el daño del arco, rompe la barrera de carga de la membrana celular y mejora la tasa de éxito de las células difíciles de transferir.

4. tratamiento postoperatorio

Después de completar la operación de transferencia eléctrica, el ratón fue trasladado de nuevo a la rata madre para mantener el ambiente cálido y tranquilo. El estado ocular y la supervivencia de los ratones se observaron todos los días después de la cirugía para garantizar que no se produjeran infecciones ni otras complicaciones.

Resultados y discusión

Detección de la eficiencia de la transfección

Tres días después de la electrotransferencia, se extrajo el globo ocular del ratón, se preparó una sección congelada de la retina y se observó la expresión de la proteína fluorescente verde (gfp) a través de un microscopio fluorescente. Los resultados mostraron que las señales fluorescentes obvias de GFP se podían ver en todas las capas de las células de la retina, especialmente en la capa de células ganglión, la capa nuclear y la capa nuclear externa, y la eficiencia de la transfección aumentó en más del 40% en comparación con los métodos tradicionales (basados en datos de prueba interna de weinid). Esto se ha beneficiado de la remodelación instantánea de la permeabilidad de la membrana celular por un campo eléctrico de alta intensidad del electroperforador de Onda cuadrada Winnie 's Gene pulse 830, logrando una entrega eficiente de macromoléculas de ácido nucleico.

Evaluación de la supervivencia celular y el daño tisular

La estructura tisular de la retina se observó a través de la Tinción de sumulina - ihong (he). las capas de retina de los ratones en el Grupo de electrotransferencia tenían una estructura clara y las células estaban bien dispuestas. en comparación con el Grupo control, no hubo necrosis celular significativa ni respuesta inflamatoria. El experimento de rechazo azul de tripan mostró que la tasa de supervivencia de las células retinianas después de la electrotransformación alcanzó más del 90%, lo que indica que esta técnica de electrotransformación tiene un pequeño daño al tejido retiniano y garantiza la viabilidad de experimentos posteriores.

Ventajas comparativas con la tecnología tradicional

Los métodos tradicionales de transfección de vectores virales tienen problemas como un largo ciclo de preparación, un alto costo y una capacidad limitada de vectores, y pueden desencadenar una respuesta inmune. Por su parte, la tecnología de electrotransformación viva mediada por el electroperforador de Onda cuadrada winned Gene pulse 830, sin embalaje viral, puede entregar directamente macromoléculas como adn, ARN y proteínas, con una operación simple, rápida y bajo costo, evitando al mismo tiempo los riesgos potenciales de los vectores virales. Su sistema de monitoreo inteligente de forma de onda completa garantiza que el proceso experimental sea transparente y controlable, y los datos se pueden rastrear para ayudar a la reproducción precisa de los resultados de la investigación científica. El sistema de optimización preprogramada incorpora una biblioteca de parámetros de líneas celulares comunes, llamada con un solo clic, y al mismo tiempo admite parámetros de pulso personalizados, adaptados a escenas complejas como la retina del ratón recién nacido, mostrando una fuerte flexibilidad y aplicabilidad.

Optimización tecnológica y precauciones

Durante el experimento, se encontró que la optimización de los parámetros de electroperforación era un factor clave que afectaba la eficiencia de la transfección. Un voltaje demasiado alto o un número excesivo de pulsos pueden causar daño celular, mientras que un voltaje demasiado bajo puede causar una eficiencia de transfección insuficiente. La función inteligente de detección de Resistencia del wijnide Gene pulse 830 puede ajustar dinámicamente los parámetros de acuerdo con la resistencia de la muestra, lo que resuelve eficazmente este problema. Además, la concentración y el volumen del Plásmido inyectado, el grado de adhesión del electrodo y la edad diaria del ratón tendrán un impacto en los resultados experimentales, y las condiciones experimentales deben controlarse estrictamente.

Perspectivas de aplicación

Área de investigación básica

Esta tecnología puede ser ampliamente utilizada en el estudio funcional de genes relacionados con el desarrollo de la retina, como la tecnología de edición genética crispr combinada con la electrotransformación, que puede lograr el knock - out o la knock - in de genes específicos de la retina y estudiar su papel en la diferenciación celular de la retina y la formación de circuitos neuronales; La entrega de SiRNA se puede utilizar para inhibir la expresión de genes objetivo y explorar el mecanismo de los genes en la aparición de enfermedades de la retina; En el estudio de la reprogramación de células madre, la tecnología de electrotransformación puede introducir eficientemente factores de reprogramación en células madre de retina y proporcionar nuevas formas para la investigación de la medicina regenerativa de retina.

Campo de la medicina traslacional

En términos de electrotransformación de tumores vivos, se puede entregar genes terapéuticos o medicamentos a través de la electrotransformación para tumores oculares como el retinoblastoma, logrando un tratamiento dirigido preciso; En el desarrollo de vacunas, la tecnología de electrotransformación puede entregar genes de antígenos a las células inmunes relacionadas con la retina, inducir respuestas inmunes y proporcionar nuevas ideas para la investigación de vacunas oculares; En cuanto a la terapia génica in vivo, la tecnología de electrotransformación puede introducir genes normales en las células de la retina para enfermedades hereditarias de la retina, como la retinopatía pigmentaria, la melanosis congénita, etc., sentando las bases para la aplicación clínica de la terapia génica.

Agricultura e Industria

Aunque la investigación se centra en la retina de ratones recién nacidos, la amplia aplicabilidad del electroperforador de Onda cuadrada Winnie 's Gene pulse 830 también le da un gran potencial en los campos agrícola e industrial. En la mejora genética vegetal, se puede utilizar para la entrega genética de protoplastos vegetales y acelerar la mejora de las variedades de cultivos; En la construcción de bacterias de ingeniería de levadura e ingeniería metabólica microbiana, la tecnología de electrotransformación puede realizar eficientemente la introducción de genes exógenos y mejorar la eficiencia de producción de bacterias de ingeniería.

Con su innovadora tecnología de pulso de onda cuadrada, sistema de monitoreo inteligente y soporte de servicio técnico profundo, El medidor de perforación eléctrica de Onda cuadrada weinide Gene pulse 830 se ha convertido en una opción de confianza para más de 500 instituciones de investigación científica de primer nivel. Ya sea la manipulación genética precisa en la investigación básica o la exploración terapéutica innovadora en la medicina traslacional, el dispositivo proporciona una plataforma técnica eficiente y confiable para los investigadores científicos. En la actualidad, weinide ofrece servicios gratuitos de consultoría de programas técnicos y pruebas de productos para ayudar a los investigadores científicos a superar las barreras técnicas de transfección y promover la investigación en Ciencias de la vida y el desarrollo de campos relacionados.

Referencias

1. cambios en la expresión de genes relacionados con la angiogénesis y el estrés por oxígeno en la retinopatía de ratones recién nacidos inducida por oxígeno [j] Yu zengyang, Gong chenyuan, Zhang guoqing. Boletín farmacológico de china. 2014, número 010

2. expresión de la proteína quimiotaxia monocelulares - 1 en un modelo de ratón recién nacido con retinopatía inducida por oxígeno [j] Dong ning, Chu liqun, Xiao lin. Chinese Journal of experimental oftalmología. 2012, número 004

3. expresión de la proteína quimiotaxia monocelulares - 1 en un modelo de ratón recién nacido con retinopatía inducida por oxígeno [j] Dong ning, Chu liqun, Xiao lin. Chinese Journal of experimental oftalmología. 2012, número 004

4. cambios en la expresión de MCP - 1 en el tejido retiniano de ratones recién nacidos y su importancia [j] Dong ning, Chu liqun, Xiao lin. Shandong pharmaceutical. 2011, número 026

5. expresión de MMP - 2 en un modelo de ratón recién nacido con retinopatía prematura [j] Jiang shuang, Chen xiaolong. Journal of Liaoning Medical college. 2009, número 006