En el paradigma de investigación de la Metabolómica tradicional (incluida la lipómica, el mismo a continuación), la Metabolómica no dirigida tiene como objetivo obtener el perfil metabólico completo de la muestra utilizando espectrometría de masas de alta resolución, proporcionando una amplia visión de los metabolitos de moléculas pequeñas; La Metabolómica dirigida utiliza principalmente la espectrometría de masas tripolar y cuádruple para lograr una cuantificación precisa de los metabolitos. A medida que la demanda de análisis de muestras a gran escala se expandió, los investigadores comenzaron a buscar un equilibrio entre la alta cobertura del análisis no dirigido del metabolismo y la alta precisión del análisis dirigido, creando técnicas metabólicas a gran escala (incluyendo la Metabolómica dirigida amplia y la Metabolómica dirigida, que no se distingue en este artículo).

La Metabolómica a gran escala se centra en más de mil metabolitos básicos del Organismo y toma muestras directamente en la Plataforma de espectrometría de masas tripolar utilizando el modo de monitoreo de respuesta selectiva (srm) o monitoreo de reacción múltiple (mrm). al tiempo que garantiza la cobertura de los metabolitos, puede mejorar significativamente la sensibilidad y especificidad de detección de los metabolitos de baja abundancia, despedirse de los problemas del procesamiento masivo de información en análisis no dirigidos, proporcionar un rango dinámico más amplio de detección de metabolitos, una reproducibilidad de datos más sólida y una precisión cuantitativa relativa, y proporcionar una base de datos sólida y confiable para el análisis de muestras a gran escala. Sin embargo, debido a la limitación de la velocidad de escaneo de la espectrometría de masas tripolar, por lo general, cada metabolito solo puede conservar entre 1 y 2 subiones para garantizar el flujo de análisis de metabolitos, reduciendo así la fiabilidad de la identificación de metabolitos.

Thermo Scientific ™ Stellar ™ La espectrometría de masas fusiona orbitrap Ascend ™ Cuadrupolo segmentado Hiperboloide superior, trampa de iones lineales de doble presión y orbitrap astral ™ El detector PMT superior ha logrado una velocidad de escaneo sin precedentes de la espectrometría de masas de trampa de iones lineales. Pionera en la aplicación del modo de monitoreo de reacción paralela (prm) desde el instrumento orbitrap hasta la espectrometría de masas de trampas iónicas, ha logrado un análisis cualitativo y cuantitativo simultáneo de la Metabolómica a gran escala, lo que permite obtener tanto la precisión como la fiabilidad cuantitativa de la identificación de metabolitos.

Thermo Scientific ™ Stellar ™ Espectrómetro de masas

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Stellar ms admite la transformación de datos de alta resolución no dirigidos y abre el circuito cerrado de "descubrimiento - verificación"

Una de las estrategias clásicas de la Metabolómica a gran escala es transformar los datos DDA recogidos por la espectrometría de masas de alta resolución en pares de iones mrm programados para la verificación del modo srm, logrando un circuito cerrado de "descubrimiento - verificación". Hoy en día, este flujo de trabajo se puede implementar fácilmente en la transformación de los datos de espectrometría de masas de alta resolución de orbitrap en el método Stellar prm, como se muestra en la figura 1. Compound Discoverer ™ Software y mzvault ™ El software puede convertir los metabolitos identificados por el patrón DDA de la espectrometría de masas de alta resolución en Stellar ™ Lista de PRM compatible con espectrometría de masas y biblioteca de espectrometría de masas secundaria (.msp), por lo que es rastrefinder ™ O Skyline ™ El software se utiliza para el trabajo cualitativo y cuantitativo de metabolitos. Skyline ™ La función del software PRM producer admite la optimización automática del canal de adquisición PRM programado para reducir el impacto de los metabolitos de salida común en la velocidad de escaneo. Encontramos que las mismas muestras de plasma tienen una reproducibilidad extremadamente alta en los resultados de Escaneo completo de la espectrometría de masas de alta resolución y los resultados del análisis de Stellar PRM (cribado de la característica de inyección repetida de tres inyecciones de CVS inferior al 30%), lo que indica que la espectrometría de masas Stellar puede verificar los marcadores metabólicos encontrados sin objetivo a nivel de muestra a gran escala.

Figura 1 proceso de desarrollo y presentación de resultados de la metodología metabólica a gran escala Stellar PRM basada en espectrometría de masas de alta resolución (haga clic para ver la imagen grande)

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Stellar ms admite la transferencia rápida del método de triple cuadrupolo para lograr la cuantificación cualitativa simultánea

Si los usuarios han desarrollado previamente métodos de análisis metabolómicos dirigidos a objetivo o ampliamente dirigidos en la Plataforma de espectrometría de masas tripolar, Stellar ™ La espectrometría de masas también puede lograr una rápida transferencia del método original. Bajo la premisa de que el tiempo de retención puede ser altamente reproducible (el mismo sistema de fase líquida), Stellar ™ El espectrómetro de masas puede convertir directamente la lista SRM / mrm en el método prm; Incluso si el tiempo de retención no se puede reproducir en diferentes sistemas de cromatografía, los usuarios pueden hacerlo directamente en Stellar ™ El instrumento construye rápidamente un banco a través de la adquisición de etiquetas mixtas para actualizar el tiempo de retención del compuesto y el espectro secundario. A diferencia de los métodos tradicionales de SRM / mrm, el modo PRM proporciona un espectro secundario completo de los metabolitos a medir, sin necesidad de agregar canales de recolección adicionales a expensas del flujo de análisis de los metabolitos, se puede lograr la caracterización y cuantificación simultáneas de los metabolitos y aumentar aún más la confianza en la identificación de los metabolitos. (figura 2)

Figura 2. Stellar PRM realiza un análisis dirigido a las características metabólicas recogidas por la espectrometría de masas de alta resolución (haga clic para ver la imagen grande)

Los ácidos biliares son el producto final del metabolismo del colesterol. los ácidos biliares primarios en el cuerpo humano pueden transformarse de la flora intestinal a ácidos biliares secundarios más activos biológicamente. tienen un papel importante en el mantenimiento del equilibrio del colesterol y la regulación del metabolismo glucémico y lipídico y la respuesta inflamatoria en el organismo. Vamos a ser científicos antes ™ TSQ Altis ™ El método cuantitativo de ácidos biliares construido en el espectrómetro de masas tripolar se transfiere rápidamente a Stellar a través del proceso mostrado en la figura 3. ™ En la ms, se lograron 33 ácidos biliares endógenos para la cuantificación cualitativa simultánea.

Figura 3. lista de ácidos biliares SRM / mrm transferencia de métodos PRM y cuantificación cualitativa simultánea (haga clic para ver la imagen grande)

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Stellar ms apoya el desarrollo de la lipómica dirigida desde cero para lograr una cuantificación precisa de los triglicéridos

Debido a que los lípidos tienen un tiempo de retención predecible y una espectrometría de masas secundaria, son muy adecuados para el análisis cuasi - dirigido. Skyline ™ La función lipidcreator del software puede generar una espectrometría de masas secundaria de varios iones de adición de lípidos, que se utiliza directamente para el desarrollo de métodos lipómicos dirigidos desde cero. La Carnitina de acilo (accar) es una de las sustancias clave en los mamíferos para regular el equilibrio del metabolismo glucémico y lipídico, que no solo puede ayudar a los ácidos grasos a desplazarse a las mitocondrias para la beta - oxidación, sino que también puede regular la producción de cetonas con la participación del metabolismo glucémico. Los estudios han demostrado que la Carnitina de acilo está estrechamente relacionada con una variedad de enfermedades metabólicas y se ha utilizado ampliamente en el diagnóstico clínico de enfermedades metabólicas genéticas neonatales. La Carnitina de acilo tiene iones de fragmentos específicos (m / Z 144, M / Z 85, M / Z 60, y pérdida neutral de cadenas específicas de ácidos grasos), que se pueden obtener directamente utilizando la predicción de lipidcreator. Aplicando el modelo Stellar prm, identificamos 207 y 340 tipos de acil - Carnitina en plasma y orina, respectivamente, como se muestra en la figura 4.

Figura 4. identificación de acil - Carnitina por el método Stellar PRM

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Stellar ms admite el escaneo conjunto de espectrometría de masas multietapa para lograr un análisis preciso de los isómeros

En el análisis lipídico, la cuantificación de triglicéridos (tg) con tres cadenas de grasa es particularmente desafiante. Por ejemplo, cuando se utiliza el modo SRM / mrm para cuantificar el Tg (50: 4), independientemente de la pérdida de neutralidad utilizada, solo se puede determinar la composición de una de las cadenas de grasas, como el uso cuantitativo de fragmentos de pérdida de neutralidad fa16: 0 (m / Z 573.7) que solo pueden demostrar la presencia de fa16: 0 en el Tg (50: 4), pero no se puede obtener información sobre la composición de las dos cadenas de ácidos grasos restantes. Y Stellar ms3La composición de las tres cadenas de grasa de Tg se puede localizar con precisión para lograr una cuantificación precisa de los triglicéridos (figura 5).

Figura 5. método Stellar tms3 para cuantificar con precisión los triglicéridos

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La espectrometría de masas Stellar no requiere la configuración de ms por separado3El método se puede utilizar directamente en paralelo con el modo PRM para la caracterización y cuantificación de metabolitos, lo que mejora en gran medida la flexibilidad del método. Además de la cuantificación de los triglicéridos, MS3También se puede utilizar para la cuantificación precisa de isómeros, como el ácido glicidodeoxicólico (gcdca) y el ácido glicidodeoxicólico (gdca) en la familia de ácidos biliares, que pueden aumentar la ms al mismo tiempo que la cuantificación del prm.3El canal mejora su sensibilidad cuantitativa y precisión de identificación (figura 6).

Figura 6. Stellar tms3 cuantifica con precisión los isómeros de ácidos biliares

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La tecnología Metabolómica a gran escala rompe con las limitaciones de la complejidad de los datos metabolómicos tradicionales no dirigidos y la baja cobertura del análisis dirigido. un experimento puede obtener una detección completa de miles de metabolitos, al tiempo que obtiene una alta sensibilidad y alta reproducibilidad del análisis dirigido al hombro. Thermo Scientific ™ Stellar ™ La aparición de la espectrometría de masas marca un salto revolucionario en la tecnología de análisis metabólico a gran escala, que combina la excelente cuantificación de la espectrometría de masas de cuatro polos y la fuerte capacidad cualitativa de la trampa de iones lineales de doble presión para acelerar la transformación clínica de la investigación científica, impulsando en gran medida los escenarios de aplicación de la Metabolómica en el análisis de muestras a gran escala, como la investigación de equipos clínicos y el dibujo personalizado de mapas metabólicos nutricionales, para revelar los profundos misterios del metabolismo de la vida con datos más precisos.

Referencias:

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Zheng F, Zhao X, Zeng Z, et al. Desarrollo de un método de metabolómica pseudodirigida al plasma basado en espectrometría de masas por cromatografía líquida de ultra alto rendimiento. Nat Protoc. 2020; 15(8):2519-2537.

3. Chiang JY. Ácidos biliares: regulación de la síntesis. [J] J Lipid Res. 2009; 50(10): 1955-1966.

4. Di Yu, Lina Zhou, Qiuhui Xuan, et al. Estrategia para la identificación integral de acilcarnitinas basada en cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución. [J] Anal. Química. 2018, 90(9), 5712–5718.

5. Lauren Bishop, Brittany Lee, Charles Maxey, et al. Combinación de enfoques dirigidos MS2 y MS3 para la cuantificación de ácidos biliares en muestras biológicas utilizando el espectrómetro de masas Stellar. [PO]Thermo Fisher Scientific, Inc.

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