Las infecciones bacterianas patógenas representan una grave amenaza para la salud pública, especialmente en las heridas crónicas y agudas, donde la colonización bacteriana y la formación de biopelículas dificultan la curación de las heridas. Las terapias basadas en especies reactivas de oxígeno (ros) tienen las ventajas de un amplio espectro de actividad antibacteriana y baja resistencia a los medicamentos, y ahora se han convertido en una estrategia no antibiótica para tratar heridas infectadas. Sin embargo, su aplicación clínica sigue limitada por problemas como la baja eficiencia de la administración, la mala orientación bacteriana y la inflamación descontrolada después del tratamiento.

Con este fin, el equipo del profesor Li Wei de la facultad de farmacia de la Universidad de Wuhan ha diseñado un parche multifuncional de microagujas de doble capa (lft / S - cn) para esterilizar eficazmente y promover la curación de heridas. El parche combina nanopartículas a base de Lactoferrina (lft nps) cargadas positivamente con un sensor acústico de porfirina (tappfe) y se coloca en una capa Basal soluble, mientras carga el antiinflamatorio spermidina (spd) en la capa puntiaguda de respuesta al Ph. Cuando la microaguja se inserta en el tejido infectado, los NPS LFT liberados pueden apuntar y agrupar eficazmente bacterias cargadas negativamente, generando una gran cantidad de ROS a través de la terapia quimiodinámica y sonodinámica coordinada (cdt / sdt) estimulada por ultrasonido. Al mismo tiempo, El microambiente ácido de la herida desencadena la degradación gradual de la capa de la punta de la aguja, logrando así la liberación controlada del SPD y la inmunomodulación. En el modelo de herida de ratón infectado por Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa), el parche LFT / S - mns redujo significativamente la carga bacteriana, inhibió la respuesta inflamatoria, promovió la deposición de colágeno y la formación de nuevos vasos sanguíneos, y aceleró el cierre de la herida.

Este trabajo propone una prometedora estrategia no antibiótica para lograr la antibacteriana y la regeneración de tejidos de la herida a través de cdt / SDT coordinados y la regulación inflamatoria. El chip de microaguja utiliza la tecnología de litografía micro - estereoscópica de proyección de superficie de precisión de Mo Fang (p μsl) (microarch) ® S240， Precisión: 10 micras) el molde de impresión y procesamiento 3D se prepara después de ser volcado y moldeado por pdms, y los resultados de la investigación se publican en la revista Journal of Controlled Release bajo el título "tres - en - un bilayer microseedle patch for Ultrasound - Active antibacterian Therapy and immune modular in World health". Jiang peng, un estudiante de doctorado de 2023 de la facultad de farmacia de la Universidad de wuhan, es el autor de la tesis, el profesor Li Wei es el autor de la correspondencia de la tesis y la facultad de farmacia de la Universidad de Wuhan es la unidad de finalización de la tesis. el trabajo de investigación anterior ha sido apoyado por El proyecto de la Fundación Nacional de ciencias naturales de China y los fondos Pi del Centro de Medicina de la vida Taikang de la Universidad de wuhan.

Como se muestra en la figura 1, el parche integra nanopartículas de Lactoferrina cargadas positivamente (lft np) acopladas al sensor acústico de porfirina (tappfe) en una base soluble, así como una capa puntiaguda de respuesta al pH que soporta el antiinflamatorio Arginina (spd). Después de la inserción en el tejido infectado, el LFT NP liberado apunta y agrupa eficazmente bacterias con carga negativa, produciendo así un ROS potente a través de la quimioquinética colaborativa y la terapia sonodinámica (cdt / sdt) estimulada por ultrasonido. Al mismo tiempo, El microambiente de la herida ácida desencadena la degradación gradual de la capa puntiaguda y la liberación controlable de SPD para la inmunomodulación. En el modelo de herida de ratón infectado por Pseudomonas aeruginosa, el parche LFT / S - min redujo significativamente la carga bacteriana, frenó la inflamación, promovió la deposición de colágeno y la formación de nuevos vasos sanguíneos, y aceleró el cierre de la herida.

Figura 1. diagrama esquemático de la estructura y el mecanismo terapéutico del parche LFT / S - CN para el tratamiento de heridas infectadas. (a) el diseño y preparación de parches LFT / S - mns de doble capa está compuesto por una capa base soluble cargada con carga positiva LFT NPS y una capa puntiaguda de respuesta al pH que encapsula spd. (b) después de la inserción en la herida infectada, la capa basal disuelve rápidamente y libera LFT nps, que apuntan activamente a bacterias con carga negativa, y producen ROS bajo los Estados Unidos mediante la colaboración de SDT y cdt, logrando una eliminación efectiva de bacterias. Al mismo tiempo, El microambiente de la herida ácida desencadena la degradación de la capa puntiaguda, lo que resulta en la liberación continua del SPD para la regulación inflamatoria. Esta estrategia conjunta promueve la eliminación de bacterias, La inmunomodulación y la regeneración de tejidos, lo que finalmente acelera la curación de las heridas.

Con el fin de lograr la especificidad del sitio y controlar la liberación de medicamentos, se preparó un parche mnn de doble capa de respuesta al pH utilizando una estrategia de moldeo secuencial, llamado Parche LFT / S - mnn. Para visualizar y verificar la estructura, dos sondas fluorescentes, la seroalbúmina bovina (rhb - bsa) marcada por Rodamina B y la isotianato de Luciferina (fitc), se cargaron en las capas puntiagudas y básicas de las nanopartículas, respectivamente (figuras 2A y b). La capa puntiaguda se sintetiza mediante polimerización de radicales libres inducida por ultravioleta y enlace cruzado de base Schiff entre el metacrilato de chitosan (csma) y spdta. la capa base está compuesta por un 18% en peso de alcohol polivinílico (pva) y una solución de sacarosa, y la capa posterior está compuesta por un 20% en peso de poliestireno (ps). El análisis del espectro de energía de rayos X de dispersión energética (eds) (figura 2c) muestra que los elementos de hierro de los NPS LFT están distribuidos uniformemente, limitados a la capa base, mientras que los elementos de carbono de la capa puntiaguda están distribuidos uniformemente, lo que indica una clara separación espacial. El parche LFT / S - mnn obtenido está compuesto por una matriz de 10 × 10 mnn, con una envergadura de unos 0,5 cm2 (figura 2d). Cada aguja tiene una forma cónica clara, de unos 850 micras de altura, y tiene una clara estructura de doble capa (figuras 2E y f). Las pruebas mecánicas mostraron una fuerza de rotura de aproximadamente 4n por aguja (figura 2g), suficiente para lograr una inserción percutánea efectiva y posibles aplicaciones clínicas.

Figura 2. caracterización del parche LFT / S - CN. Imágenes representativas de campo brillante y fluorescencia de los parches (a - b) LFT / S - mn, que ilustran la integridad estructural y el marcado fluorescente de los componentes dopados. (c) el espectro de energía confirma la distribución de elementos dentro de los mns. (d) las imágenes ópticas y las imágenes SEM (e, f) muestran la morfología de LFT / S - mns. Las líneas punteadas amarillas representan la interfaz entre la capa puntiaguda de respuesta pH y la base soluble. (g) la curva de fuerza - desplazamiento de LFT / S - mns indica que su resistencia mecánica es adecuada para la penetración cutánea.

Se utilizó piel de cerdo in vitro para evaluar la capacidad de penetración cutánea del parche LFT / S - min. Después de la aplicación, el mns rompió con éxito la cutícula y transportó el tinte fluorescente encapsulado a la piel, que se mostró en imágenes fluorescentes (figura 3a) y se confirmó en la sección transversal de la histología (figura 3b). El comportamiento de disolución y la liberación posterior de los NPS LFT se observaron mediante un microscopio fluorescente. Como se muestra en la figura 3c, la base se disuelve en PBS (ph 7,4) en 80 segundos, lo que promueve la liberación rápida de LFT NPS de la base mn. Teniendo en cuenta que el microambiente de la herida infectada suele ser ácido, los autores estudiaron más a fondo el comportamiento de respuesta al pH de la punta de mnn. Los estudios de Liberación in vitro han demostrado que la capa puntiaguda se degrada gradualmente en condiciones ácidas leves (ph 5,6) y casi al día 15, mientras que en condiciones neutras (ph 7,4) se produce una degradación mínima (figura 3d), lo que indica el comportamiento sensible al ácido de la capa puntiaguda. Determinación cuantitativa de la eficiencia de carga y entrega de medicamentos (figuras 3E y f). El LFT fue de 145,43 ± 2,76 μg y el SPD fue de 14,96 ± 0,08 μg. Después de la administración cutánea, la dosis de LFT a través de mns fue de 132,83 ± 2,91 microgramos, y la dosis de SPD a través de mns fue de 14,38 ± 0,22 microgramos, y la tasa de eficacia de ambos medicamentos superó el 90%. Además, la liberación acumulada del SPD en condiciones ácidas (ph 5,6) alcanzó el 88,87 ± 3,58% en el día 15, significativamente más alta que la del PBS (ph 7,4), lo que confirma aún más el espectro de Liberación de respuesta ácida de la punta del mnn (figura 3g).

Figura 3. evaluación de la liberación de fármacos de los parches LFT / S - min. (a) imágenes representativas de campos brillantes y microscopía fluorescente de la piel de cerdo in vitro después de la implantación del parche LFT / S - mn. (b) secciones histopatológicas de la piel de cerdo después de la implantación del parche mn. (c) las imágenes ópticas muestran la rápida disolución de la capa base y la separación de la capa puntiaguda en el PBS en 80 segundos. (d) las imágenes del microscopio fluorescente invertido muestran la degradación de MN en 15 días en diferentes condiciones de pH (ph 7,4 y 5,6), simulando un ambiente de herida neutral y ligeramente ácido. (e) cuantificación de la carga y entrega de LFT de parches LFT / S - min. (f) cuantificación de la carga y entrega de SPD de parches LFT / S - min. (g) curva de Liberación acumulada in vitro de SPD con el tiempo en LFT / S - mns. Los datos se expresaron en medio ± SD (n = 3 muestras independientes).

Los autores evaluaron sistemáticamente el efecto antibacteriano in vitro de los parches LFT / S - min. Como se muestra en la figura 4d, la concentración mínima de inhibición (mic) de LFT bajo irradiación ultrasónica (3 mhz, 0,97 W / cm2, 50% de ciclo de trabajo, 30 min) es de 128 μg / ML. Los parches individuales de LFT / S - mnn mostraron una actividad antibacteriana moderada, con una tasa de inhibición de 36,41 ± 0,75% frente a Estafilococos aureus y 35,87 ± 1,48% frente a Pseudomonas aeruginosa (figuras 4a y e). Por el contrario, después de la activación por ultrasonido, la tasa antibacteriana del parche LFT / S - MN aumentó significativamente, 99,95 ± 0,04% y 99,96 ± 0,04%, respectivamente (figura 4e), lo que indica que la bacteria está casi inactivada. Estos resultados fueron validados aún más por la tinción syto 9 / pi, en la que el Grupo LFT / S - mnus mostró la principal fluorescencia roja, indicando una amplia muerte bacteriana (figuras 4b y f). La microscopía electrónica de barrido (sem) proporciona evidencia morfológica adicional; Las bacterias del Grupo no tratado mantuvieron una membrana completa y lisa, mientras que las expuestas a LFT / S - mns activadas por ultrasonido mostraron daños estructurales significativos y ruptura de la membrana (figura 4c). En general, estos hallazgos confirman que después de la activación por ultrasonido, los parches LFT / S - mnn pueden producir una gran cantidad de ROS local, eliminando así eficazmente las bacterias en el lugar de la lesión.

Figura 4. estudio sobre las propiedades antibacterianas in vitro del parche LFT / S - min. (a) una foto representativa de la placa de agar que muestra el efecto antibacteriano de LFT / S - mns sobre Estafilococos aureus y Pseudomonas aeruginosa. (b) las imágenes del microscopio fluorescente muestran Estafilococos aureus y pseudomonas aeruginosa produciendo estrés oxidativo causado por ROS en diferentes condiciones de tratamiento. (c) imágenes Sem de la morfología bacteriana procesada que muestran la destrucción de la membrana y la deformación estructural de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa. (d) la concentración mínima inhibidora (mic) de LFT frente a Estafilococos aureus en LFT / S - mns mostró una actividad antibacteriana dependiente de la dosis. La Flecha Roja indica el valor MIC del lft. (e) análisis cuantitativo de la vitalidad bacteriana después de diferentes tratamientos, evaluado por manchas vivas / muertas. (f) los resultados de las mediciones correspondientes de la intensidad de fluorescencia verde (fi) en el experimento vivo / muerto confirmaron aún más la acción antibacteriana. Los datos se mostraron como media ± SD (n = 3 muestras independientes). ** p < 0.01，** p < 0.001，**** p < 0.0001。 NS significa que no hay significación.

Para verificar el efecto terapéutico in vivo del parche LFT / S - min, los autores utilizaron Pseudomonas aeruginosa..P. aeruginosa) establecer un modelo de infección de heridas cutáneas en ratones (figura 5a). Los ratones infectados se dividieron aleatoriamente en ocho grupos (n = 5 en cada grupo), incluidos los grupos no ultrasónicos (blanco, S - mn, LF / S - mn, LFT / S - mn) y los grupos tratados por ultrasonido (blanco + us, S - MN + us, LF / S - MN + us, LFT / S - mnn + us). El esquema de ultrasonido incluye una exposición diaria de 3 mhz, 0,97 W / cm2, 50% de ciclo de trabajo, 30 minutos, 3 días consecutivos. La progresión de la herida se monitoriza mediante fotografía los días 0, 1, 3, 5 y 9 posteriores al tratamiento (figura 5b). En el primer día, los exudados purulentos disminuyeron significativamente en el Grupo LFT / S - MN + us, lo que refleja la acción antibacteriana combinada de cdt y sdt. Por el contrario, los grupos no ultrasónicos mostraron sepsis e inflamación más extensas. El día 3, una vez completada la administración por ultrasonido, se tomaron muestras de la cama de la herida para el cultivo de bacterias y se evaluó la carga bacteriana residual (figura 5e). El recuento de la placa mostró la menor formación de colonias en el Grupo LFT / S - MN + us, lo que indica una mayor actividad antibacteriana en su cuerpo (figura 5f). Para el día 9, los ratones tratados con LFT / S - MN + Us tenían una alta tasa de curación de heridas y una regeneración tisular obvia (figura 5c). A lo largo del tratamiento, el monitoreo de peso mostró que no hubo fluctuaciones significativas entre los grupos (figura 5d), lo que indica que el parche MN tiene una buena biocompatibilidad sistémica. En resumen, estos resultados sugieren que la combinación de LFT / S - mns con ultrasonido puede eliminar eficazmente las infecciones bacterianas y acelerar significativamente la curación de las heridas en el cuerpo.

Figura 5. efecto antibacteriano in vivo y propiedades de curación de heridas de las pegatinas LFT / S - min. (a) diagrama esquemático del modelo de herida del ratón infectado por Pseudomonas aeruginosa y estrategia de tratamiento con parches MN más o sin estimulación us. B) fotografías representativas del lugar de la herida a los días 0, 1, 3, 5 y 9 después del tratamiento. El círculo punteado Negro indica el límite inicial de la herida. (c) análisis cuantitativo de la curación de la herida con el tiempo en cada grupo de tratamiento (n = 5). (d) monitoreo del peso corporal de los ratones durante el tratamiento (n = 5). (e) fotos de placas de Agar de colonias bacterianas cultivadas en camas de heridas el tercer día de cada grupo. (f) cuantificación de la vitalidad bacteriana basada en el análisis de la unidad formadora de colonias (cfu) (n = 3). Los datos se expresan en medio ± sd. *** p < 0.001，**** p < 0.0001。 NS significa que no hay significación.

Conclusiones:Este estudio ha desarrollado con éxito un parche de microagujas de doble capa sensible al pH (lft / S - cn) que logra un tratamiento eficiente de las heridas infectadas mediante la integración de la terapia antibacteriana colaborativa activada por ultrasonido (cdt / sdt) con la inmunomodulación desencadenada por el microambiente ácido. El parche no solo libera rápidamente los NPS LFT de las bacterias diana, produce una gran cantidad de ROS bajo ultrasonido para eliminar bacterias y biopelículas, sino que también libera continuamente SPD en condiciones ácidas de la herida, regula la polarización de los macrófagos e inhibe la inflamación excesiva. Los experimentos in vivo han confirmado que esta estrategia puede acelerar significativamente el cierre de heridas, promover la regeneración de tejidos y tener una excelente bioseguridad. Este trabajo proporciona una nueva estrategia con potencial de transformación clínica para el tratamiento de heridas infectadas no dependientes de antibióticos y la regeneración de tejidos.