Malentendido uno: cuanto más canales de instrumentos, mejor.

Con la madurez y aplicación de la tecnología pcr, la amplificación múltiple es cada vez más animada, y el PCR cuantitativo fluorescente no es inmune. Desde el desarrollo del PCR cuantitativo fluorescente de un solo canal lanzado por la compañía Abi a principios de Zui hasta el lanzamiento del PCR cuantitativo fluorescente de 4, 5 o incluso 6 canales lanzado por varios fabricantes hoy en día, las opciones deslumbrantes hacen que la gente se sienta perdida, y algunas personas entran accidentalmente en el malentendido de que "cuanto más canales, mejor".

Cuando se utilizan cuantitadores fluorescentes de 5 canales de algunos fabricantes, para garantizar la exactitud y precisión de los resultados experimentales, se utiliza rox (un tinte fluorescente) o Reference Dye en el experimento, que deben utilizar un canal de detección separado. De esta manera, solo hay cuatro canales efectivos para detectar realmente señales fluorescentes PCR múltiples, y el uso de tintes de corrección puede aumentar los costos de uso posteriores. Algunos canales de detección de PCR cuantitativo fluorescente están abiertos solo a tintes o reactivos fluorescentes de sus propios fabricantes, y los canales de detección efectivos no son tantos como se afirman en los materiales promocionales. Es particularmente importante confirmar los canales de detección efectivos de los instrumentos PCR cuantitativos fluorescentes antes de la compra, y no se puede escuchar solo la propaganda. También se debe considerar el número de canales de la PCR cuantitativa fluorescente múltiple a partir de la situación real del laboratorio. la PCR múltiple no es aplicable para todos y está disponible para todos, porque complica el experimento.

Malentendido dos: el PCR en tiempo real no necesita función de gradiente

Para las reacciones PCR cuantitativas utilizando el método de tinte, aunque hay una variedad de software de diseño de primer PCR o fórmulas empíricas para calcular la temperatura de fusión (valor tm), las fórmulas utilizadas son diferentes, las secuencias de primer son diferentes, y los valores de Tm varían mucho. La temperatura de fusión del primer determina la temperatura de recocido. Y la combinación de bases en la plantilla es muy variable, para fragmentos especiales, los datos obtenidos por la Fórmula empírica no necesariamente pueden obtener resultados precisos, las diferencias sutiles en la temperatura de recocido pueden tener un impacto decisivo en los resultados, por lo que las "condiciones de tacto" una vez fueron un dolor de cabeza. La aparición de la PCR de gradiente resuelve parcialmente algunos problemas: las condiciones de control de temperatura de cada agujero durante la reacción pueden cambiar de acuerdo con el gradiente en el rango, y según los resultados, las condiciones de reacción se pueden explorar en un solo paso.

No solo la temperatura de recocido, sino también la temperatura de desnaturalización y la temperatura de extensión se pueden optimizar - Esto es muy importante para la mayoría de las enzimas Taq de alta fidelidad amplificadas por múltiples enzimas mixtas de polimerasa como invitrogen, clontech y promega, ya que puede haber diferencias significativas entre la temperatura de reacción * de Taq y la enzima de corrección, y es importante optimizar la temperatura de extensión.

El uso de PCR cuantitativo fluorescente con función de gradiente puede completar el proceso de optimización que se puede completar con muchos experimentos anteriores a la vez, lo que simplifica los experimentos engorrosos para explorar las condiciones de reacción de pcr, lo que no sólo ahorra tiempo experimental, sino que también ahorra costos experimentales.