El instrumento de PCR cuantitativo fluorescente (qpcr) es el equipo central en los campos de la investigación de biología molecular y el diagnóstico clínico (como la detección del nuevo coronavirus), y su precisión afecta directamente la fiabilidad de los resultados experimentales. La corrección (calibración) es un paso clave para garantizar la estabilidad del rendimiento del instrumento qpcr, que requiere una verificación y ajuste sistemáticos regulares del sistema de control de temperatura (precisión del control de temperatura) y el sistema óptico (detección de señales fluorescentes).

I. objetivos básicos de la corrección

La corrección del instrumento qpcr tiene como objetivo garantizar que los siguientes indicadores clave de rendimiento cumplan los requisitos:

Sistema de control de temperatura: error de indicación de la temperatura (desviación de la temperatura establecida de la temperatura real), uniformidad de la temperatura (diferencia de temperatura entre los agujeros de reacción), fluctuación de la temperatura (cambio de temperatura con el tiempo), sobreimpulso máximo de la temperatura (la magnitud que excede el valor establecido durante el calentamiento / enfriamiento), tasa de enfriamiento uniforme (velocidad de calentamiento / enfriamiento).

Sistema óptico: precisión de la intensidad de fluorescencia (consistencia de la señal de fluorescencia del mismo agujero), precisión del número de ciclo umbral (valor ct) (consistencia del valor CT de diferentes agujeros), deriva de la temperatura de fusión (desviación de temperatura cuando la intensidad de fluorescencia disminuye a la mitad), coeficiente de correlación lineal de fluorescencia (relación lineal entre la intensidad de fluorescencia y La concentración de ácido nucleico).

II. preparativos previos a la corrección

1. condiciones ambientales

Temperatura: 15 - 30 ° c (evitar fluctuaciones de temperatura que afecten los resultados de calibración);

Humedad relativa: 20 - 85% RH (para evitar la humedad del instrumento);

Fuente de alimentación: estabilizar el voltaje (se recomienda usar ups) para evitar que el corte de energía afecte el proceso de calibración.

2. equipo y materiales

Sustancias de referencia: es necesario utilizar sustancias de referencia certificadas (como el ADN plasmídico y las sustancias de referencia de ácido ribonucleico), y sus cantidades características (número de copias ≥ 10 copias / μl) y la incertidumbre de expansión relativa (≤ 5%) deben cumplir con los requisitos de jjf (jin) 04 - 2020;

Equipo de calibración: simulador óptico (sensor de temperatura integrado y generador de luz emisor, rango de medición de temperatura 0 - 120 ° c, error máximo permitido ± 0,1 ° c; longitud de onda de luz emitida 360 - 780 nm, intensidad de radiación óptica relativa ajustable), verificador de temperatura multicanal (como jdpc - 96, para medir la diferencia de temperatura entre los agujeros de reacción);

Consumibles: placas de calibración especiales (como la placa de calibración ab7500 roi, la placa de calibración de fondo), pipeta (2 μl, 10 μl, etc., que requieren verificación metrológica calificada), guantes sin polvo (placa de calibración para evitar la contaminación).

III. proceso principal de corrección

El proceso de corrección del instrumento qpcr debe seguir estrictamente el Código de calibración del instrumento de PCR cuantitativo fluorescente en tiempo real jjf (jin) 04 - 2020, que incluye principalmente dos partes: calibración del sistema de temperatura y calibración del sistema óptico. los siguientes pasos específicos se explican tomando como ejemplo el instrumento de la serie ab7500:

(1) calibración del sistema de temperatura

La temperatura es el parámetro central de la reacción qpcr, que afecta directamente la eficiencia de la amplificación del adn. La calibración del sistema de temperatura requiere el uso de un simulador óptico (tubo de reacción alternativo) para simular los cambios de temperatura en la reacción real y verificar el rendimiento de control de temperatura del instrumento.

1. preparación antes de la calibración

Conecte el simulador óptico con el instrumento qpcr para asegurarse de que el sensor de temperatura inferior esté en buen contacto con la fuente de emisión de fluorescencia superior y el bloque de calor del instrumento;

Aplicar aceite térmico bajo el simulador óptico para mejorar la conducción térmica;

Abra el software del instrumento, seleccione el módulo de "calibración" y ingrese al programa de "calibración de temperatura".

2. procedimiento de calibración

Precalentamiento: establecer la temperatura del instrumento a 23 ° C y ejecutar el programa de precalentamiento (unos 10 minutos) para que el instrumento alcance un Estado estable;

Configuración del punto de temperatura: seleccione 9 puntos de temperatura (30 ° c, 50 ° c, 60 ° c, 70 ° c, 90 ° c, 95 ° c, etc.), cada punto de temperatura dura 2 minutos (para medir el error de indicación de temperatura, uniformidad, fluctuación);

Proceso de calentamiento / enfriamiento: de 50 ° C a 90 ° c (medición de la tasa media de calentamiento), y luego de 90 ° C a 50 ° c (medición de la tasa media de enfriamiento);

Adquisición de datos: el instrumento registra automáticamente la temperatura establecida (ts), el promedio de temperatura real (t), el valor de fluctuación de temperatura (t v), el valor máximo de sobreimpulso (t os) en cada punto de temperatura.

3. cálculo de los resultados

Error de indicación de temperatura: △ t = TS - T (requisito ≤ 0,5 ° c);

Uniformidad de la temperatura: △ tu = T umax - T umin (t umax es la temperatura máxima de todos los agujeros y T umin es la mínima, que requiere ≤ 1,0 ° c);

Fluctuación de la temperatura: △ t v = + (t Max - T min) / 2 (t Max es la temperatura máxima de un solo agujero, t Min es el valor mínimo, se requiere ≤ 0,2 ° c);

Exceso máximo de impulso de temperatura: △ t os = tosmax - TS (tosmax es el máximo de exceso de impulso de todos los agujeros, requisito ≤ 3,0 ℃);

Tasa media de calentamiento: V up = (tb - ta) / Tut (tb es la media del punto de temperatura de 90 ° c, ta es la media del punto de temperatura de 50 ° c, Tut es el tiempo de calentamiento, que requiere ≥ 4 ° C / s);

Tasa media de enfriamiento: V down = (tb - ta) / tdo (tdo es el tiempo de enfriamiento, que requiere ≥ 3 ° C / s).

Ii) calibración del sistema óptico

El sistema óptico es responsable de detectar señales fluorescentes, y su precisión afecta directamente los resultados cuantitativos del valor CT y la concentración de ácido nucleico. La calibración del sistema óptico requiere el uso de una placa de calibración especial (como la placa de calibración ab7500 roi) para ajustar la sensibilidad del detector fluorescente a la consistencia de la señal.

1. calibración de fondo

Objetivo: eliminar la interferencia de la fluorescencia de fondo del instrumento (como la contaminación de señales electrónicas y consumibles plásticos);

Pasos:

(1) retire la placa de calibración de fondo (se necesita colocarla a temperatura ambiente durante 5 minutos para evitar la condensación);

(2) cargar la placa de calibración en el instrumento y ejecutar el programa de "calibración de fondo" (unos 30 minutos);

(3) el software registra automáticamente la señal de fluorescencia de fondo y genera un archivo de corrección de fondo (deducido automáticamente en experimentos posteriores).

2. calibración del Roi (zona de interés)

Objetivo: mapear la posición del agujero en la placa de reacción al detector del instrumento para garantizar la adquisición precisa de la señal fluorescente de cada agujero;

Pasos:

(1) retire la placa de calibración del Roi (placa estándar o placa rápida, se necesita un desplazamiento de 5 segundos y una centrifugación de 2 minutos);

(2) cargar la placa de calibración en el instrumento y ejecutar el programa de "calibración roi";

(3) el software toma automáticamente la imagen de cada filtro y genera una máscara de Roi (se muestra un círculo verde alrededor de cada agujero, lo que indica que la calibración es exitosa);

(4) si la imagen está sobresaturada (la fluorescencia en el agujero es demasiado fuerte), es necesario ajustar el tiempo de exposición (por ejemplo, reducir de 2048 a 1024) y volver a capturar la imagen.

3. calibración óptica

Objetivo: compensar los efectos físicos del sistema óptico (como la respuesta espectral del filtro) y garantizar la precisión de la señal fluorescente;

Pasos:

(1) seleccione el programa de "calibración óptica" y cargue el archivo de calibración del roi;

(2) ejecutar el programa (unos 10 minutos), el software analiza automáticamente las características espectrales de la señal fluorescente y genera un archivo de corrección óptica.

4. calibración de tintes

Objetivo: verificar la precisión de las señales fluorescentes de diferentes tintes (como fam, vic, rox) y garantizar la fiabilidad de los experimentos de múltiples tintes;

Pasos:

(1) retire la placa de calibración de tintes (que contiene una variedad de tintes fluorescentes, como cy3, cy5, fam, etc.);

(2) cargar la placa de calibración en el instrumento y ejecutar el programa de "calibración de tintes";

(3) el software recoge automáticamente el espectro de fluorescencia de cada tinte y genera un archivo de corrección de tinte (señal de tinte de identificación automática en experimentos posteriores).

(3) registro de resultados y certificado

Una vez finalizada la calibración, es necesario emitir un certificado de calibración certificado por cnas, que incluya lo siguiente:

(1) información básica del instrumento (modelo, número de serie, fabricante);

(2) condiciones ambientales de calibración (temperatura, humedad, tiempo);

(3) resultados de calibración (error de indicación de temperatura, uniformidad, precisión del sistema óptico, etc.);

(4) firma del personal de calibración y del personal de auditoría;

(5) calificación de la institución de calibración (número de reconocimiento cnas).

IV. precauciones para la corrección

1. ciclo de calibración

Se recomienda realizar una calibración completa cada 12 meses (cumplir con los requisitos de jjf (jin) 04 - 2020);

La alta frecuencia de uso (como operar más de 10 veces al día) o las aplicaciones clave (como el diagnóstico clínico) se pueden reducir a 6 meses;

Después de que el instrumento se traslade, repare o reemplace los componentes clave (como bloques de calefacción, detectores), es necesario recalibrar.

2. apoyo profesional

La calibración debe ser realizada por ingenieros del fabricante o instituciones de terceros calificadas (como la Academia de Ciencias de supervisión y pruebas metrológicas de tianjin) para garantizar el cumplimiento de sop (procedimientos operativos estándar);

Está prohibido que los no profesionales ajusten los parámetros del instrumento (como la configuración de temperatura y los filtros ópticos) por sí mismos para no afectar los resultados de la calibración.

3. verificación después de la calibración

Una vez finalizada la calibración, es necesario realizar experimentos de verificación de materiales de referencia (como materiales de referencia de ADN plasmídico) para detectar la repetibilidad del valor CT (coeficiente de variación ≤ 3%) y el coeficiente de correlación lineal (r m2 ≥ 0,99) para garantizar el efecto de calibración;

Si los resultados de la verificación no cumplen con los requisitos, es necesario recalibrar o contactar con el fabricante para repararlos.

V. problemas y soluciones comunes

1. la uniformidad de la temperatura no cumple con los requisitos

Causa: contaminación por bloques de calor (como productos PCR residuales), envejecimiento del sensor de temperatura;

Solución: limpiar el bloque de igualación de calor (limpiar con etanol anhidro) y reemplazar el sensor de temperatura.

2. baja intensidad de la señal fluorescente

Causa: falla en la calibración del Roi (error de mapeo de agujeros), fluorescencia de fondo demasiado alta;

Solución: volver a calibrar el roi, ejecutar la calibración de fondo (reemplazar la placa de calibración de fondo).

3. el valor CT varía mucho

Causa: fluctuación de temperatura excesiva (como bloque de calentamiento inestable), disminución de la sensibilidad del detector fluorescente;

Solución: comprobar la estabilidad de la temperatura del bloque de calefacción (medido con un verificador de temperatura multicanal) y reemplazar el detector de fluorescencia.

VI. Resumen

La corrección del PCR cuantitativo fluorescente es un paso clave para garantizar que los datos experimentales sean precisos y confiables, y es necesario seguir estrictamente las normas de la industria (como jjf1527 - 2015, jjf (jin) 04 - 2020) y calibrar regularmente el sistema de control de temperatura y el sistema óptico. Durante el proceso de calibración, se deben prestar atención a las condiciones ambientales, el apoyo profesional y la verificación de los resultados para garantizar que el rendimiento del instrumento cumpla con los requisitos experimentales. A través del proceso de corrección estandarizado, se puede reducir efectivamente el error experimental y mejorar la precisión y repetibilidad de los resultados de qpcr.