Anatomía del microscopio fluorescente del Olimpo

2018 / 7 / 26 7: 52: 45 publicado por: admin

Con otros basados en las características de la muestra macroMicroscopio ópticoEn comparación con los patrones, como el gradiente de fase, la absorción de luz y la birefringencia, el microscopio fluorescente puede visualizar la distribución de un solo tipo de molécula basándose únicamente en las características de la emisión de fluorescencia. Así, con un microscopio fluorescente se puede monitorizar la ubicación precisa de los componentes intracelulares marcados con grupos fluorescentes específicos, así como los coeficientes de difusión asociados a ellos, las características de transporte y otrosBiologíaInteracción molecular. Además, la respuesta significativa de la fluorescencia a las variables ambientales locales permite estudiar el ph, la viscosidad, el índice de refracción, la concentración de iones, el potencial de membrana y la polaridad del disolvente en células y tejidos vivos.

La configuración temprana del microscopio fluorescente utiliza la transmisión clásica de campo brillante o oscuro..Luz transmitida(...)Sistema óptico, centrándose la luz estimulada a través del filtro en el plano de la muestra. Las emisiones fluorescentes y una gran cantidad de excitación se recogen a través del objetivo y se proyectan en el diafragma del ojo a través del segundo filtro para formar una imagen intermedia. Debido a que la intensidad de la luminiscencia suele ser varios órdenes de magnitud mayor que la emisión de fluorescencia, las vistas de las muestras en estos primeros microscopios de transmisión suelen tener un contraste muy bajo y se superponen a un fondo lleno de excitación dispersa. El uso de concentradores de campo oscuro inmersos en aceite de alta Apertura numérica para iluminar las muestras con un azimut altamente inclinado ayuda a eliminar la mayor parte del ruido de fondo, pero no proporciona suficiente iluminación, excepto las lentes de apertura numérica baja. La imagen resultante tiene una mala resolución y un brillo muy bajo.

Microscopía fluorescente y luz incidente..Luz reflejadaLa iluminación (o eyección) se desarrolló por primera vez a finales de la década de 1920 para observar las emisiones fluorescentes en muestras metalúrgicas opacas. Al igual que sus homólogos de campo brillante, estos instrumentos de fluorescencia de luz reflectante utilizan un divisor de haz semireflectante, con una eficiencia total de alrededor del 25% (pérdida del 50% de la iluminación cada vez que pasan por el espejo). Sin embargo, el microscopio de fluorescencia de luz reflejada goza de las ventajas de tener un objetivo de apertura numérica alta como concentrador y es capaz de producir imágenes de un nivel significativamente más alto que el microscopio de luz transmitida que opera bajo una apertura numérica similar. Además, la luminiscencia desordenada del reflector (bajo una apertura numérica alta) se reduce a solo unos pocos por ciento. La doble acción del objetivo en el microscopio de luz reflejada también simplifica significativamente la tarea de alineación. Solo enfocando el objetivo en la muestra se establecen campos de iluminación y campo de visión, de modo que la luz de excitación incidente y la emisión de fluorescencia observada sigan el mismo camino a través de la serie óptica del microscopio.

Cuando a mediados de la década de 1930 se desarrollaron lámparas compactas de descarga de vapor de mercurio y arco de xenón, los avances tecnológicos en las fuentes de luz de iluminación impulsaron la transformación de la fluorescencia de luz reflejada (al menos para la metalografía). Durante este período, los filtros de vidrio y gelatina de color también se complicaron, lo que permitió aplicar tintes fluorescentes estimulados por la luz visible azul y verde utilizando lámparas halógenos de tungsteno. Los recubrimientos antirreflectantes y las fórmulas de vidrio mejoradas llevaron a importantes mejoras en el diseño de los lentes en la década de 1940, pero la contribución fundamental al desarrollo de los microscopios de fluorescencia de luz incidente fue la introducción de un espectrómetro dicromático (también conocido como espejo dicromático) iniciado por el científico óptico ruso eugeny brumberg en 1948. Esta innovación supera el problema de la pérdida de luz inherente al uso de semirreflectores ordinarios en microscopios de luz reflejada. El microscopio fluorescente de luz reflejada fue comercializado por primera vez por Johan S. Ploem a finales de la década de 1960 y desempeñó un papel importante en el desarrollo del Wild - leitz Ploem opak, que contiene múltiples módulos ópticos intercambiables y está equipado con diversas combinaciones de filtros de microscopio fluorescente.

Estrategia básica del microscopio fluorescente de caída

La gran mayoría de los microscopios de fluorescencia de luz reflejada son métodos de selección actuales para el estudio de campo ancho de fuentes de luz no coherentes, así como aquellos realizados con confocalización de escaneo láser e instrumentos multiphoton. Este popular modo de microscopía de fluorescencia también se llama fluorescencia de luz incidente, fluorescencia reflectante o fluorescencia de caída simple. Los microscopios modernos de fluorescencia de luz reflejada típicos también están equipados con observaciones de luz transmitida en varios modos de mejora del contraste, como se muestra en la figura 1. El microscopio contiene una cabeza de Observación de tres ojos acoplada al sistema de cámaras del dispositivo de acoplamiento de carga (cld), con dos fuentes de iluminación, una para la transmisión de luz y otra para la observación (descarga de arco de tungsteno - halógeno y mercurio, respectivamente). El microscopio diseñado puede combinar o alternar el contraste de fase entre la fluorescencia de la luz reflejada y la luz transmitida, el contraste de interferencia diferencial (tic), la luz polarizada o la observación del contraste de modulación Hoffman.

La característica básica de cualquier microscopio fluorescente es proporcionar un mecanismo para estimular la muestra, que tiene una iluminación filtrada selectivamente, y luego utilizar un segundo filtro para separar las emisiones fluorescentes más débiles para formar una imagen con una gran sensibilidad en un fondo oscuro. En muchos experimentos, la concentración de sondas locales en muestras biológicas es muy baja y solo una pequeña parte de la luminiscencia es absorbida por sustancias fluorescentes. Además, en aquellos grupos fluorescentes que pueden absorber una cierta cantidad de radiación, el porcentaje de fluorescencia secundaria emitida es aún menor. El nivel de brillo de emisión de fluorescencia obtenido será de tres a seis órdenes de magnitud inferior al nivel de brillo de la iluminación. Por lo tanto, el problema básico de los microscopios fluorescentes es producir una iluminación eficiente de las muestras, al tiempo que captan emisiones de fluorescencia débil que se separan efectivamente de las bandas de iluminación más fuertes. En los instrumentos fluorescentes modernos se cumplen estas condiciones mediante una combinación de filtros que coordinan los requisitos de excitación y emisión basados en la acción y las características de los divisores de haz bicolor.

La figura 2 ofrece una visión general de los principios detrás de la función del divisor de haz Dicolor (espejo) en un microscopio de fluorescencia de luz reflejada, que contiene una muestra imaginaria de un fluorescente que estimula y emite una longitud de onda Roja (620 a 660 nanómetros) en una región verde (550 nanómetros). Espectro visible. Las fuentes de luz de alta intensidad emiten una amplia gama de longitudes de onda de excitación a una alta densidad de flujo (que suele cubrir la mayor parte de los rayos ultravioleta y todo el espectro visible), que pasan por el iluminador y se encuentran primero con un filtro que selecciona la banda de excitación adecuada (marcado como ef; Véase la figura 2 (a)). En este caso, el filtro pasa con alta eficiencia por la luz de entre 510 y 560 nanómetros de longitud de onda, pero también permite que otras longitudes de onda pasen en menor medida. La luz de excitación llega luego al Dicolor (dm en la figura 2) y se refleja en el agujero trasero del objetivo para formar una iluminación cónica que ilumina la muestra. El espejo bicolor, situado en el camino óptico en un ángulo de 45 grados, está diseñado para reflejar selectivamente las longitudes de onda entre 490 y 565 nanómetros (como se muestra en la figura 3), mientras transmite longitudes de onda más cortas y más largas.

La figura 3 muestra la curva de transmisión de la combinación de filtros para separar la luz estimulada de la emisión de fluorescencia en la figura 2. El espectro del filtro de excitación (curva roja) muestra un alto nivel de transmisión (alrededor del 80%) entre 510 y 560 nanómetros. Longitud de onda central (cwl) 535 nanómetros. El espejo bicolor (curva amarilla) refleja las longitudes de onda en la región espectral de excitación, mientras pasa por longitudes de onda más altas y más bajas con una eficiencia relativamente alta. Tenga en cuenta que la transmisión porcentual en la curva espejo bicolor corresponde al 100% de reflexión. Una disminución significativa en la distribución de la transmisión entre 490 y 570 nanómetros (que representa el pico de la reflectividad) se utiliza para reflejar la banda de longitud de onda que entra en la muestra desde el filtro de excitación en un ángulo de 90 grados. Este último componente de la serie óptica, el filtro de emisión o barrera (curva blanca), transmite una longitud de onda superior a 590 nanómetros, lo que corresponde a la luz visible con amarillo, naranja y rojo. Los límites entre las bandas de transmisión y reflexión de varios espectros superpuestos están diseñados para ser lo más empinados posible para garantizar una separación casi * de las longitudes de onda de reflexión y transmisión. El patrón de picos ascendentes y descendentes sinusoidales en el espectro del espejo bicolor es un efecto común del proceso de deposición de película delgada, conocido como ruido constante. El rendimiento de esta combinación de filtros es muy excelente, lo que demuestra claramente el rápido desarrollo de la tecnología de filtros de interferencia de película fina.

Debido a que solo la luz de ancho estrecho de banda se refleja en el espejo bicolor, la longitud de onda de iluminación que logra estimular el filtro es más corta que 490 nanómetros y más larga que 565 nanómetros también se transmite a través del espejo bicolor, como se muestra en la luz por encima del Corte. En la figura 2 a). Tenga en cuenta que el reflejo de la luminiscencia no es 100% efectivo, por lo que una pequeña cantidad de luz verde pasa por el espejo bicolor sin ser reflejada. Además, no toda la luz de longitud de onda superior a 565 o inferior a 490 nanómetros pasa por el espejo. Una pequeña parte de esta luz se refleja en la muestra a través del espejo a través del objetivo.

La emisión fluorescente (principalmente la longitud de onda roja) de la muestra producida por la excitación de la luz verde se agrupa por el objetivo y pasa por el Dicolor y el filtro de barrera (por encima de la luz cortada en la figura 2 (c). El filtro de barrera (marcado como BF en la figura 2) está especialmente diseñado para permitir que solo la luz de longitud de onda superior a 590 nanómetros llegue a las gafas del microscopio y / o al detector. Para esta tarea, el filtro de barrera es eficaz para evitar que la longitud de onda de luz estimulada reflejada desde la muestra (y que ha pasado con éxito por el dicolor) llegue al detector. Sin embargo, la mayor parte de la longitud de onda de excitación devuelta de la muestra se refleja en el filtro de excitación y el emisor de luz por el Dicolor (luz por debajo de la luz de corte en la figura 2 (c). El efecto neto de la configuración del filtro que se muestra en las figuras 2 y 3 es separar la luz estimulada de una intensidad significativamente mayor de las emisiones fluorescentes más débiles. En todos los casos, como se muestra en la imagen, el nivel de corte del filtro involucrado en el microscopio fluorescente no es, pero puede hacer que algunas luces fuera del rango de longitud de onda penetren. Toda la secuencia de eventos se muestra gráficamente en la figura 2 (b), en la que se explican las rutas ópticas y la disposición de los filtros de estrategia necesarios para un microscopio fluorescente de luz reflectante efectivo.

Iluminador fluorescente vertical

El núcleo del microscopio fluorescente moderno es el iluminador vertical universal de luz reflejada, que se inserta en el tubo de observación y lleva el objetivo.ObjetivoEntre convertidores, como se muestra en las figuras 1 y 4. El iluminador está diseñado para guiar la luz producida por el resaltado - colocando la fuente de intensidad sobre la muestra primero haciendo que la luz se dirija a la muestra a través del objetivo del microscopio y luego capturando la luz emitida por la muestra con el mismo objetivo. Este tipo de estrategia de iluminación tiene varias ventajas. El objetivo del microscopio actúa primero como un concentrador bien corregido y luego recoge la emisión de fluorescencia de la imagen para transmitirla al sistema de detección de la lente ocular o Cámara. Por lo tanto, el objetivo siempre está correctamente alineado con respecto a cada función. Además, la mayor parte de la luminiscencia dispersa o reflejada por la muestra (en un ángulo de 360 grados) se aleja del elemento de lente frontal del objetivo y no se proyecta directamente en el vidrio, como en el caso de la luminiscencia transmitida. Este efecto se llama iluminación frontal y es especialmente adecuado para especímenes gruesos. Después, el área de muestra irradiada está limitada a la misma zona observada, y tanto la iluminación como la recolección de luz pueden utilizar la apertura numérica completa del objetivo.

En el extremo lejano del iluminador vertical se encuentra la Caja de luz (véase la figura 4), que contiene una descarga de arco de alta intensidad o una fuente de luz incandescente a base de incandescencia. Las fuentes de iluminación populares son las lámparas de arco de mercurio de 100 vatios de alta tensión (hbo, comúnmente conocidas como quemadores), pero también se pueden utilizar lámparas de arco de xenón y haluro metálico, láseres y lámparas incandescentes de haluro de tungsteno para este propósito. La luz emitida por la fuente de luz se centra por el sistema de lentes de concentración y viaja por el interior del iluminador paralelo a la Mesa y perpendicular al eje óptico del microscopio. El diseño del emisor de luz que se muestra en la figura 4 incluye un sistema de lentes colectoras de múltiples componentes, pero también se implementan elementos de lentes asféricas para mejorar la corrección de la diferencia de color en las regiones de infrarrojo cercano y ultravioleta. Los filtros térmicos diseñados para eliminar o inhibir la longitud de onda infrarroja se colocan en el interior de la propia Caja de luz o en el asiento de montaje de la Caja de luz adyacente a la parte trasera del iluminador vertical. Además, algunos microscopios contienen sistemas cerca de la Caja de luz del equilibrador de excitación de doble o múltiple frecuencia (ver figuras 4 y 8) que filtran selectivamente las longitudes de onda no necesarias para la excitación para ajustar el rendimiento del Grupo de filtros fluorescentes contenidos en el otro extremo del iluminador.

También cerca de la Caja de luz en el iluminador vertical se encuentra un conjunto de filtros de densidad neutra que permiten ajustar la intensidad total de la luz que pasa por el sistema y reducir el desvanecimiento fluorescente o el fotoblanqueamiento. Estos filtros suelen instalarse en el marco del deslizador, lo que le permite insertar rápidamente el camino de luz y eliminarlo del camino de luz mientras observa la fluorescencia de la muestra. Para establecer la iluminación köhler, la iluminación vertical contiene una combinación de apertura Centrista y apertura del campo de visión, ambas con aperturas variables que determinan el tamaño del campo y la intensidad de la iluminación. La alineación de la apertura y la apertura del campo y el ajuste del tamaño de la apertura se logran a través de varios pares de perillas ubicadas en cada lado exterior de la carcasa del iluminador vertical. En algunos diseños, se proporciona una Perilla deslizante para retirar todo el componente de apertura del camino de luz para maximizar la cantidad de luz que pasa por el iluminador. Otros microscopios contienen agujeros de aguja de tamaño fijo, instalados en deslizadores deslizantes, que pueden insertar caminos de luz, limitando considerablemente el campo de iluminación y son adecuados para aplicaciones especiales como la investigación de recuperación de fluorescencia (frap) después del blanqueamiento de la luz.

Detrás de las aperturas y aperturas de campo en la serie óptica del iluminador vertical está la lente de campo, necesaria para difundir la luz y generar suficiente campo de iluminación para establecer la iluminación kohler. Detrás del espejo de campo, todos los iluminadores verticales modernos contienen una esclusa óptica (con Control Manual del interruptor) que impide que una fuerte luminiscencia llegue al Grupo de filtros y muestras cuando no se observa o registra la fluorescencia. El obturador es una característica clave del microscopio fluorescente, ya que la exposición continua de la muestra puede reducir significativamente las emisiones causadas por el fotoblanqueamiento, que no es saludable para las células vivas. Además, el obturador mantiene activa la lámpara de descarga de arco eléctrico (reduciendo el tiempo de calentamiento) mientras inspecciona instantáneamente el espécimen con luz transmitida. Los microscopios fluorescentes suelen estar equipados con Obturadores electrónicos que permiten controlar la iluminación de forma rápida y remota. La cubierta protectora contra los rayos ultravioleta (marcada en la figura 4) está instalada en la parte delantera de la carcasa del iluminador para proteger al operador de fugas accidentales de radiación ultravioleta de onda corta potencialmente peligrosa cuando se abre el obturador. la cubierta sirve de doble función al proteger el espécimen de la exhalación durante la observación.

Varios diseños de iluminadores verticales proporcionan ranuras para marcos de polarizadores rectangulares, que se pueden utilizar para el estudio de polarización fluorescente. En la mayoría de los casos, el polarizador se inserta en el camino de iluminación detrás del espejo de campo (lejos del plano de unión), pero antes de la esclusa (véase la figura 4). El polarizador puede fijarse en su lugar con una orientación de transmisión predeterminada o instalarse en el Grupo de engranajes, lo que permite cambiar la dirección del eje de transmisión mediante el uso de ruedas digitales. Debido a que el polarizador está montado en un marco deslizante, se puede retirar fácilmente del Camino óptico cuando no está en uso. El analizador que lo acompaña (el segundo polarizador necesario para la medición de la heterogeneidad fluorescente) puede instalarse en un iluminador vertical por encima de la torreta del bloque de filtro o en un tubo intermedio de un microscopio de polarización especialmente diseñado. El tubo auxiliar es generalmente capaz de insertar una unidad de polarizador rotativo degradado para garantizar el posicionamiento preciso de la orientación de transmisión del analizador con respecto al eje óptico del polarizador y el microscopio.

La etapa posterior del iluminador vertical contiene una mesa giratoria o un soporte deslizante que contiene un bloque óptico que contiene una combinación de filtros fluorescentes. Cuando es necesario combinar una imagen con un filtro fluorescente específico, el bloque del filtro gira (o se desliza) en la serie óptica. Un solo bloque contiene un conjunto de filtros de excitación y emisión coincidentes, así como un espectrómetro bicolor, todos los cuales están cuidadosamente posicionados para maximizar la irradiación de la muestra y capturar emisiones fluorescentes de una longitud de onda específica. La Torre giratoria del bloque óptico y el soporte del deslizador pueden cargar de tres a seis bloques separados, uno de los cuales se encuentra en el camino óptico, mientras que los demás giran o se deslizan fuera del almacenamiento temporal. Estos accesorios son capaces de convertir rápidamente entre conjuntos de filtros fluorescentes al observar muestras marcadas con dos o más sondas fluorescentes. El uso de la iluminación transmitida en microscopios equipados con iluminadores fluorescentes se facilita mediante bloques ópticos virtuales ensamblados en ranuras en soportes giratorios o deslizadores. El bloque virtual bloquea la emisión de excitación (cuando se abre el obturador), pero no contiene ningún filtro y permite que la luz pase sin obstáculos desde el objetivo a través del tubo de observación.

En un microscopio vertical modular estándar, el iluminador vertical se encuentraMicroscopioEntre el marco y el tubo de observación (véase la figura 1). Muchos fabricantes ofrecen tubos intermedios que se pueden insertar entre iluminadores y unidades de gafas para polarizantes, prismas TIC u otros accesorios. Los marcos de microscopía modernos suelen ser el resultado de esfuerzos de diseño asistido por computadora que conducen a características ergonómicas significativas de amortiguación y mejora. Los materiales sintéticos, como la cerámica a base de metal y los compuestos de aluminio, pueden mejorar significativamente la rigidez estática y térmica del marco, lo que permite al instrumento soportar los estrictos requisitos de las técnicas avanzadas de fluorescencia, que requieren un largo período de tiempo * Eliminación de vibraciones para imágenes de emisiones débiles de fluorescencia.

Iluminación del microscopio fluorescente Köhler

En los iluminadores verticales fluorescentes, la fuente de luz se posiciona de manera que la bola de plasma de descarga de alambre fino o arco se encuentre cerca del foco principal de la lente de enfoque. En la iluminación de köhler, el foco actúa como una fuente de luz auxiliar que aumenta significativamente para mejorar la iluminación general. Uno de los principales requisitos para la iluminación de Köhler es que la imagen del filamento o arco debe proyectarse finalmente en el plano focal trasero del objetivo, que también es el doble (generalmente Apertura numérica alta) del concentrador durante la excitación de la luz reflejada. Idealmente, la fuente de luz debe llenar todo el agujero del objetivo para aumentar la intensidad de la radiación y generar un campo de radiación uniforme. En algunos casos, puntos calientes). Sin embargo, debido a que los filtros de difusión también reducen la iluminación, se debe evitar su uso en la medida de lo posible.

En la iluminación reflectante de Köhler (mostrada esquemáticamente en la figura 5), la imagen de la fuente de luz se centra por una lente de enfoque en un diafragma de apertura situado en un iluminador vertical. La apertura comparte un plano de unión con el agujero trasero del objetivo y el arco de la lámpara o el filamento, por lo que se determina el tamaño del agujero de campo de la irradiación. Fuente de luz, la apertura del iluminador vertical y el plano focal trasero del objetivo (pupila) forman un grupo de iluminación con un plano de unión. A diferencia del caso de un microscopio de luz transmitida, la apertura del agujero y la fuente de luz se visualizan en el plano del agujero trasero del objetivo (actuando como concentrador) en lugar de colocarse físicamente en esa posición. Como beneficio añadido de esta configuración, todos los obstáculos (como la apertura del iris) se eliminan de la trayectoria óptica cuando el objetivo proporciona una iluminación estimulada o cuando se forma una imagen por una emisión fluorescente agregada. Abrir o cerrar la apertura se utiliza para controlar el astigmatismo y ajustar la intensidad de la iluminación (apertura numérica) sin cambiar el tamaño del campo de iluminación. En la imagen, el ajuste de la apertura afectará el brillo y el contraste.

La imagen o el Grupo de campos de los planos conjugados en la iluminación Köhler de la luz reflejada consiste en una apertura de campo, una superficie de muestra y un plano de imagen intermedio. Por lo tanto, cuando la apertura en el acto se centra en el plano de la muestra, la imagen de la fuente de luz se retira significativamente del foco para proporcionar un campo de iluminación uniforme. La apertura del campo de visión controla el tamaño del campo de iluminación sin afectar la intensidad de iluminación de la zona observada. En la práctica, el tamaño de la apertura de la apertura de la apertura del campo debe ser lo más pequeño posible para aumentar el contraste de la imagen y reducir el grado de fotoblanqueamiento en áreas que no se observan directamente. Aunque la intensidad de la iluminación producida por la mayoría de las fuentes de descarga de arco y de incandescencia es desigual, la iluminación Köhler puede iluminar uniformemente el campo de muestra. Después de configurar correctamente el microscopio, el plano focal trasero * del objetivo se ilumina, proporcionando un área uniforme y brillante desde el borde hasta el borde. En el caso ideal, la iluminación de Köhler baña la muestra con un conjunto de frentes de onda convergentes, cada uno formado por puntos separados en la fuente de luz que se visualizan en la apertura del concentrador. En un microscopio fluorescente correctamente configurado, el resultado es el contraste y la resolución de la imagen. En el caso ideal, la muestra se baña con un conjunto de frentes de onda convergentes, cada uno de los cuales es generado por diferentes puntos en la fuente de luz desde la que se toma la imagen hasta el agujero del concentrador. En un microscopio fluorescente correctamente configurado, el resultado es el contraste y la resolución de la imagen. En el caso ideal, la muestra se baña con un conjunto de frentes de onda convergentes, cada uno de los cuales pasa de la imagen a laSpotlight MirrorSe producen en diferentes puntos de la fuente de luz de la apertura. En un microscopio fluorescente correctamente configurado, el resultado es el contraste y la resolución de la imagen.

Fuentes de luz y faros

Para un análisis cuantitativo riguroso en un microscopio fluorescente, la exposición de la muestra debe ser constante en el tiempo y en el espacio durante todo el campo de visión. La inestabilidad con el tiempo suele reflejar las fluctuaciones de la radiación de la lámpara debido a los cambios en la salida de la fuente de alimentación. Por el contrario, las perturbaciones espaciales que a menudo aparecen en las lámparas de arco provienen de un fenómeno conocido como parpadeo porque las bolas de plasma se mueven de un lado a otro sobre los electrodos. El parpadeo suele producirse por fluctuaciones de la fuente de alimentación, pequeños cambios en la resistencia de los electrodos o vibraciones mecánicas. Las fuentes de luz basadas en filamentos, como las populares lámparas de haluro de tungsteno, son muy estables al trabajar con una corriente continua constante que utiliza una fuente de alimentación estabilizada. En general, la fuente de luz debe seleccionarse a partir de su contenido espectral, el tamaño del filamento en comparación con la región de apertura posterior del objetivo, la estabilidad espacial y temporal y la uniformidad de la iluminación de campo. También se debe prestar especial atención a la intensidad de la fuente de luz, ya que la longitud de onda de banda estrecha por la que pasa el filtro de excitación solo incluye una parte muy pequeña de la salida total del emisor de luz.

Las principales consideraciones para la selección de fuentes de luz para microscopios fluorescentes son las relacionadas con las estudiadas.Tintes fluorescentesRendimiento cuántico y distribución espectral ultravioleta y visible relacionada con la absorción. Además, la fuente de luz debe ser compatible con la sensibilidad del detector utilizado para capturar la imagen, ya sea el ojo humano, la película tradicional, el fotomultiplicador, el videotubo mejorado o el sistema de cámara digital. La selección también depende del modo de iluminación. El uso de descargas de arco o fuentes de halógeno de tungsteno cumple con los requisitos de los microscopios de fluorescencia de campo ancho, mientras que los microscopios confocales y multiphoton deben adaptarse a varios sistemas láser. El uso de lámparas incandescentes de tungsteno y halógeno de tungsteno ha tenido un éxito limitado, ya que la mayor parte de sus emisiones se producen en regiones rojas e Infrarrojas del espectro, mientras que la mayoría de los grupos fluorescentes están estimulados por longitudes de onda ultravioleta, azul y Verde. Además, la salida de luz de las lámparas de descarga de arco eléctrico es de 10 a 100 veces mayor que la de las lámparas halógenos de cuarzo de 12 voltios que se utilizan habitualmente para transmitir luz. La fuente de luz popular para los microscopios de fluorescencia de campo ancho es el arco de mercurio, que generalmente se incluye en la configuración básica del microscopio modelo. En algunos casos se utilizan lámparas de arco de xenón y haluro metálico, pero estos suelen limitarse a casos especiales en los que la distribución espectral y de intensidad coincide con los requisitos de un grupo fluorescente específico.

Las lámparas de mercurio y xenón están diseñadas de manera similar, excepto en las dimensiones físicas y los gases de la carcasa de la bombilla. La lámpara de mercurio contiene dos electrodos sellados a alta presión en una bombilla de vidrio de cuarzo que también contiene mercurio elemental vaporizado. Cuando la fuente de alimentación está electrificada, una serie de pulsos de alta tensión se envían a los electrodos, ionizan una pequeña parte del gas Mercury y encienden las luces. Después de la cocción, el voltaje disminuye y el gas ionizado se utiliza para transportar la corriente eléctrica y generar bolas de plasma formadas entre los dos electrodos. Durante el funcionamiento de la lámpara, la evaporación del mercurio produce una gran cantidad de calor y presión en la bombilla de vidrio, lo que finalmente produce una luz de alta intensidad. La luz producida por las lámparas de arco de mercurio se concentra en las longitudes de onda discretas de 365404040546 y 580 nanómetros, incluso si es continua en el rango ultravioleta y visible. Desde los rayos ultravioleta hasta los infrarrojos, las lámparas de xenón tienen una distribución de intensidad más uniforme a lo largo de todo el espectro. La selección de tintes fluorescentes es esencial para determinar la fuente de luz adecuada para el microscopio fluorescente. Algunas sondas fluorescentes tienen bandas de excitación que coinciden con líneas de mercurio prominentes, mientras que otras se benefician de una distribución más uniforme de la radiación de las lámparas de xenón.

La alineación correcta de las lámparas de arco en el microscopio fluorescente es crucial para lograr la iluminación Kohler y evitar áreas claras y oscuras en imágenes fluorescentes. Por lo tanto, la calidad de la Caja de luz se puede juzgar generalmente por la estabilidad de la alineación correcta de la luz y la eficiencia de la perilla de ajuste utilizada para mantener la alineación. El portalámparas deberá estar equipado con un tornillo centrado en la luz para que la imagen curvada esté centrada en el agujero trasero del objetivo, y la Caja deberá contener un filtro infrarrojo que bloquee las largas longitudes de onda en rojo lejano e infrarrojo, generando así una gran cantidad de calor. Algunas cajas de luz están diseñadas con un filtro de supresión roja incorporado (por ejemplo, Schott bg38) o una ranura para este filtro para eliminar el Fondo rojo visto a través del campo de visión en algunas aplicaciones. Además, la propia Caja de luz no debe filtrar una longitud de onda ultravioleta dañina y, preferentemente, si la carcasa se abre inadvertidamente durante la operación, debe incluir un interruptor para apagar automáticamente la luz. Después, la Caja de luz debe ser lo suficientemente fuerte como para soportar posibles explosiones de quemadores durante el funcionamiento.

La amplia diversidad de aplicaciones de los microscopios fluorescentes generalmente requiere una serie de fuentes de luz para cumplir con los requisitos de grupos fluorescentes específicos y condiciones de imagen. En algunos casos, la combinación con sistemas de cámaras ultrasensibles puede requerir una radiación muy baja, mientras que en otros estudios puede requerir una excitación láser fuerte para matar células vivas o blanquear selectivamente los fluorescentes. La longitud de onda requiere cruzar generalmente toda la región visible del espectro, así como la parte ultravioleta e infrarroja. Debido a que una sola fuente de luz no puede cumplir con estos múltiples requisitos de iluminación, los adaptadores proporcionados ahora por el fabricante pueden conectar dos o más luces a un solo microscopio al mismo tiempo.

Combinación de filtros fluorescentes

Como se mencionó anteriormente, la luz que atraviesa la lente y la apertura del iluminador vertical finalmente se encuentra con el filtro de excitación alojado en el bloque óptico, posicionado para coincidir con el cruce axial entre el camino óptico del iluminador y el sistema óptico del microscopio. Los filtros de excitación seleccionan una longitud de onda de banda estrecha del amplio espectro generado por la luz y las transmiten a los dicolores, que a su vez reflejan la luz a través del objetivo e irradian la muestra. Antes de que se forme una imagen en la apertura de la lente fija, la emisión fluorescente reunida por la lente pasa de nuevo por el espejo bicolor y el filtro de emisión o barrera. Los filtros comúnmente utilizados para separar bandas en microscopios de fluorescencia de campo ancho incluyen filtros de vidrio de color y filtros de película de interferencia (o una combinación de ambos). Determinar un filtro adecuado para cada paso del esquema de iluminación e imagen del microscopio fluorescente puede causar confusión, ya que involucra a un gran número de fabricantes de filtros, cada uno de los cuales proporciona una nomenclatura alfanumérica exclusiva para la literatura fluorescente.

La figura 7 muestra esquemáticamente lo típico.Bloque de excitación fluorescenteLa anatomía, así como los contornos espectrales relevantes del dicolor, el filtro de excitación y barrera. Los bloques de filtro suelen ser ensamblados por herramientas personalizadas proporcionadas por el fabricante, por lo que el operador puede intercambiar filtros y espejos bicolor. El filtro de excitación y barrera se fija en su lugar a través de un clip de fijación, pegamento óptico o asiento de montaje roscado circular (véase la figura 7). En general, estos filtros pueden eliminarse sin abrir el bloque óptico, ya que se encuentran por encima de los agujeros hundidos en la superficie exterior plana. Es más difícil reemplazar el espejo bicolor y se necesita * desmontar el bloque para entrar en el Interior. La mayoría de las secciones de bloques se fundieron con una Junta diagonalmente opuesta de 45 grados, lo que permite una doble tarea protegiendo el interior y apoyando el espejo bicolor en el ángulo adecuado. Después de quitar el sujetador (perno o tornillo pequeño) que une parcialmente el bloque, se puede quitar el espejo aflojando o moviendo el clip de fijación y luego sacarlo cuidadosamente del bloque. Se debe tener cuidado con los espejos bicolor, ya que los recubrimientos de interferencia generalmente no están protegidos y son fáciles de rayar. Varios fabricantes de filtros que suministran a la compañía de microscopía también ofrecen varios filtros post - venta y espejos bicolor para diversas aplicaciones fluorescentes. Después de quitar el sujetador (perno o tornillo pequeño) que une parcialmente el bloque, se puede quitar el espejo aflojando o moviendo el clip de fijación y luego sacarlo cuidadosamente del bloque. Se debe tener cuidado con los espejos bicolor, ya que los recubrimientos de interferencia generalmente no están protegidos y son fáciles de rayar. Varios fabricantes de filtros que suministran a la compañía de microscopía también ofrecen varios filtros post - venta y espejos bicolor para diversas aplicaciones fluorescentes. Después de quitar el sujetador (perno o tornillo pequeño) que une parcialmente el bloque, se puede quitar el espejo aflojando o moviendo el clip de fijación y luego sacarlo cuidadosamente del bloque. Se debe tener cuidado con los espejos bicolor, ya que los recubrimientos de interferencia generalmente no están protegidos y son fáciles de rayar. Varios fabricantes de filtros que suministran a la compañía de microscopía también ofrecen varios filtros post - venta y espejos bicolor para diversas aplicaciones fluorescentes.

El diseño de los filtros fluorescentes incluye filtros de paso largo, paso corto (filtros de borde) y series de filtros de banda estrecha, media y ancha. El espectro mostrado en la figura 7 muestra ejemplos de varios contornos de filtros comunes. El espectro del filtro emisor (curva azul) en la figura 7 es generado por un filtro de interferencia de paso largo con una longitud de onda de corte de unos 575 nanómetros. Las longitudes de onda más largas se transmiten a través de filtros, mientras que las más cortas están bloqueadas. Los filtros de excitación de paso de banda estrecha (curva roja, figura 7) del mismo grupo tienen un ancho de banda de unos 20 nanómetros, mientras que el espejo bicolor (curva verde) tiene una región de transmisión casi mediana (455 - 490 nanómetros) y filtros de paso de banda ancha (560) - 775 nanómetros). Debido a que el espejo bicolor funciona eficazmente como filtro de paso largo en verde, las regiones amarillas y rojas del espectro visible (560 a 700 nanómetros) se procesan en el Banco de filtros. El conocimiento de Trabajo sobre cómo utilizar la distribución espectral de absorción y emisión de fluorescencia para seleccionar un grupo adecuado de filtros de microscopio fluorescente es * para la implementación exitosa de la tecnología.

El espejo bicolor (o haz dividido) es un componente clave en la combinación de filtros de microscopía fluorescente, similar a los filtros de interferencia de paso largo, que se fabrican con tolerancia de materiales dieléctrico multicapa. La principal diferencia entre un espejo bicolor y un filtro de interferencia estándar es que el espejo está especialmente diseñado para reflejar y transmitir a una longitud de onda límite limitada y debe operar en un ángulo de 45 grados con respecto al eje óptico del microscopio y el emisor de luz. El espejo bicolor se posiciona de tal manera que el recubrimiento de interferencia esté orientado a la fuente de luz de excitación para reflejar una longitud de onda de excitación corta a la muestra en un ángulo de 90 grados a través del sistema óptico. El mismo espejo también debe actuar como un filtro de transmisión para transmitir la emisión de fluorescencia de larga longitud de onda del objetivo al plano de imagen. Debido a que la zona de Transición de longitud de onda entre la reflexión casi total y la gran transmisión suele limitarse a 20 o 30 nanómetros, el espejo bicolor puede distinguir con precisión las longitudes de onda de excitación y emisión.

El diseño de un grupo de filtros fluorescentes permite que una banda de longitud de onda de excitación específica coincida con precisión con la región de reflexión en el espejo bicolor. El resultado es que la luminiscencia se refleja efectivamente en la muestra a través del microscopio. La emisión de fluorescencia de la muestra debe coincidir con la región de alta transmisión en el espejo bicolor para que estas longitudes de onda puedan pasar por el detector. Los filtros de barrera no son muy importantes en todo el esquema, pero siguen siendo importantes para garantizar la eliminación de la longitud de onda de excitación de dispersión y reflexión, la fluorescencia de sondas fuera del objetivo y la intensidad general del Fondo debido a la fluorescencia espontánea. Un factor importante para crear un banco de filtros es garantizar la transmisión, la reflexión y que la curva de emisión del filtro en cuestión coincida con la curva de emisión de la región correspondiente. De lo contrario, la longitud de onda de excitación puede ser capaz de pasar por el espejo bicolor y hacer que la imagen sea inexistente, o la emisión de fluorescencia puede reflejarse inadvertidamente en el espejo para dañar el brillo de la imagen.

Incluso en una combinación de filtros que parece coincidir perfectamente, puede ocurrir una ligera superposición entre las distribuciones espectrales de cada filtro, lo que reduce el rendimiento. Cabe destacar especialmente la estimulación de la conversación cruzada entre el filtro y el dicolor, lo que permite que algunas de las excitación pasen por el espejo y se reflejen desde la pared del bloque del filtro. Como se mencionó anteriormente, la luz reflejada en un ángulo de alta inclinación puede pasar parcialmente a través del filtro de barrera para reducir el contraste de la imagen. Esta fuga a través del filtro se llama penetración o cruce, y en realidad todas las combinaciones de filtros ocurren más o menos. Una de las principales áreas de preocupación para los fabricantes de filtros y las empresas de microscopía es mejorar el diseño de las combinaciones de filtros fluorescentes para reducir los niveles de cruce.

Varias configuraciones del Grupo de filtros fluorescentes se muestran en la figura 8. La Torre giratoria del bloque de filtro (figura 8 (a)) contiene cinco bloques que pueden convertir rápidamente entre las combinaciones de filtros mientras se estudia al menos esta cantidad de grupos fluorescentes. Una de las ranuras de la torre giratoria suele estar llena de bloques ópticos virtuales o dejar espacio para la observación de la luz transmitida. Afinar el espectro de excitación para formar imágenes de muestras doblemente marcadas o múltiples, utilizando un equilibrador de excitación (figura 8 (b), que contiene un solo filtro de interferencia instalado en una articulación giratoria. Girar la barra de ajuste del equilibrador de excitación mueve el área de transmisión del filtro a una longitud de onda más corta. De esta manera, cuando el filtro del equilibrador gira desde un ángulo de incidencia de cero grados (perpendicular al eje del iluminador vertical) hasta un gran ángulo de rotación de 45 grados, el área de paso de banda del filtro puede moverse entre 25 y 50 nanómetros. El equilibrador de excitación se puede utilizar solo o en serie para cambiar el ancho de banda de excitación de los tintes fluorescentes observados para igualar la intensidad de emisión. Esta característica permite ajustar la intensidad de los grupos fluorescentes en muestras que contienen varias sondas, por ejemplo, reduciendo la emisión de fluorescencia de una sonda, al tiempo que aumenta la intensidad de otra. El equilibrador de excitación se puede utilizar solo o en serie para cambiar el ancho de banda de excitación de los tintes fluorescentes observados para igualar la intensidad de emisión. Esta característica permite ajustar la intensidad de los grupos fluorescentes en muestras que contienen varias sondas, por ejemplo, reduciendo la emisión de fluorescencia de una sonda, al tiempo que aumenta la intensidad de otra. El equilibrador de excitación se puede utilizar solo o en serie para cambiar el ancho de banda de excitación de los tintes fluorescentes observados para igualar la intensidad de emisión. Esta característica permite ajustar la intensidad de los grupos fluorescentes en muestras que contienen varias sondas, por ejemplo, reduciendo la emisión de fluorescencia de una sonda, al tiempo que aumenta la intensidad de otra.

El rápido desarrollo de la tecnología de recubrimiento de película fina se puede demostrar mediante la capacidad de producir múltiples picos de transmisión en un solo filtro de interferencia y la fabricación de bandas de reflexión y transmisión entrelazadas en un espejo bicolor. Cuando se empareja adecuadamente, se pueden combinar dos filtros multibanda y un espejo bicolor para generar múltiples conjuntos de filtros fluorescentes capaces de estimular y observar simultáneamente la emisión de varios grupos de fluorescencia. El conjunto de filtros está disponible del fabricante y está disponible para dos, tres o incluso cuatro grupos fluorescentes de la misma muestra. El principal problema de los bancos de filtros múltiples es su coste y el exceso de cruce o penetración que se produce cuando la emisión de una sonda fluorescente pasa por una zona de paso de banda para otra. En algunas muestras (y grupos de filtros), la penetración tiene un impacto significativo en la intensidad del Fondo y el contraste de la imagen. Muchos investigadores tienden a utilizar conjuntos de filtros optimizados para tomar imágenes de cada grupo de fluorescencia por separado, y luego combinar las imágenes en compuestos.

Las técnicas avanzadas de fluorescencia suelen requerir el uso de múltiples filtros de excitación y emisión con un solo dicolor. Para facilitar estos estudios, muchos microscopios fluorescentes están equipados con filtros eléctricos o deslizadores, que contienen más de seis filtros separados (véase la figura 8 c). El microscopio diseñado para deslizadores o contiene una ranura especial para insertar el deslizador en el iluminador vertical, o el deslizador del filtro puede reemplazar el deslizador que generalmente contiene un filtro de densidad neutra. En algunos diseños de microscopía, el iluminador vertical también puede acomodar el deslizador emisor, o el tubo intermedio auxiliar instalado entre el iluminador y el tubo de observación para acomodar el deslizador. En un microscopio vertical e invertido, la unidad de filtro eléctrico que contiene el filtro de excitación suele quedar atrapada en el canal óptico del iluminador vertical entre el filtro de densidad neutra y la Caja de luz. Del mismo modo, la unidad de filtro emisor eléctrico se coloca entre el iluminador vertical y el tubo de observación ocular en el diseño del microscopio vertical, pero generalmente se conecta a través del mismo puerto externo que el detector utilizado para invertir el instrumento. Los deslizadores de excitación y emisión y los filtros eléctricos son muy útiles para aplicaciones de doble y triple excitación que utilizan un solo bicolor. Al eliminar la necesidad de reposicionar los bloques de filtro al observar una sola muestra, estos accesorios permiten a los investigadores obtener un registro preciso entre imágenes.

Objetivo del microscopio fluorescente

En todas las formas de microscopía de luz reflejada, incluida la fluorescencia, la intensidad de la imagen es una función de la apertura numérica y la amplificación del objetivo. De hecho, la intensidad o brillo (definido como el flujo de fotones por unidad de área y tiempo) aumenta la cuarta potencia de la apertura numérica, pero solo es inversamente proporcional al cuadrado de la amplificación:

Intensidad alfa (naobj) 4 / M 2

Entre ellos, na es la apertura numérica del objetivo y M. es la ampliación. A partir de esta relación, se puede ver claramente que las imágenes fluorescentes brillantes pasarán de tener un altoApertura numéricaY la aglomeración de lentes de baja tasa de expansión (por ejemplo, 0,75 / 20x). Por ejemplo, un objetivo inmerso en aceite multicolor del plan 60x con una apertura numérica de 1,4 producirá teóricamente una imagen más brillante que un objetivo de 100 veces la misma apertura numérica, pero debe considerarse un compromiso. Aumentar el número de elementos de lente interna (al igual que las lentes de alta apertura numérica) produce una fluorescencia espontánea y un aumento correspondiente de la reflexión de reducción de intensidad desde la superficie de la lente interna. Por lo general, el fabricante hace un compromiso entre el factor positivo universitario y la mayor transmisión de luz en el microscopio fluorescente que recomienda.

En general, los aceites de apertura numérica alta (1,3 a 1,4) y el agua (1,2) se sumergen en el programa de fluorita y las lentes de recotización plana para producir imágenes fluorescentes brillantes debido a su enorme capacidad de concentración. Estas lentes muestran una excelente corrección de color, por lo que son capaces de enfocar múltiples longitudes de onda de emisión de fluorescencia en el mismo plano. Las propiedades de transmisión de la luz de la colorimetría y la luciérnaga son * cuando son tan bajas como unos 350 nanómetros, lo que es necesario para comprobar los tintes fluorescentes (por ejemplo, dapi, hoechst, Alexa Flower - 350 y amc) que se estimulan en la región ultravioleta. A pesar de las numerosas lentes internas, estas lentes están hechas de vidrio de baja fluorescencia con recubrimiento antirreflectante para minimizar la fluorescencia de fondo y generar imágenes de muy alto contraste.

Las lentes objetivo especialmente diseñadas para aplicaciones especiales se utilizan ampliamente en microscopios fluorescentes. Esta categoría incluye inmersión en agua de apertura numérica alta, inmersión múltiple (aceite, agua y glicerina), así como lentes ultravioleta con elementos de lente de cuarzo. Para las aplicaciones de imágenes de células vivas, es necesario un objetivo de larga distancia de trabajo con anillo de corrección para observar la muestra cultivando una pared de botella gruesa (0,5 - 2 mm). Facilitar el examen de las profundidades de las muestras gruesas a través de lentes con una distancia focal muy larga (distancia de trabajo), que se pueden obtener de varios fabricantes para cubrir las imágenes de las gafas por aire o agua. Las lentes de inmersión en agua de larga distancia de trabajo diseñadas para no tener láminas de vidrio cubiertas también tienen un cono frontal de teflon, por lo que pueden sumergirse en una solución de agua. Se produce una lente similar para la excitación ultravioleta (340 nanómetros) en el agua a una distancia de trabajo de 20 a 30 mm (incluido aproximadamente 5 mm de agua). Para estudios de amplificación relativamente bajos, se recomienda el uso de una lente de inmersión en agua de 20 veces con una apertura numérica * (0,75 a 0,95). Aunque muy caros, estas lentes producen imágenes extremadamente brillantes cuando la concentración de grupos fluorescentes y / o el rendimiento cuántico son insignificantes.

Accesorios para microscopía fluorescente

Los fabricantes producen constantemente unidades de accesorios adicionales útiles para sus instrumentos para aumentar las opciones disponibles para la creciente aplicación de imágenes en microscopios fluorescentes. Por ejemplo, en algunos microscopios se puede seleccionar una apertura de campo rectangular (véase la figura 9), que puede limitar el área de la muestra iluminada para aumentar el contraste y reducir el fotoblanqueamiento. La apertura de campo modular reemplaza la apertura tradicional en la iluminación vertical (también es un módulo desmontable) y está diseñada para coincidir con la relación de aspecto del sensor de imagen digital. La parada del campo rectangular mejora la eficiencia de la iluminación de Kohler y reduce la relación señal - ruido de los sensores electrónicos. Como beneficio adicional, cuando se utiliza una etapa de escaneo programable en un estudio de deconvolución, se puede ajustar el tamaño del rectángulo de la imagen para coincidir con el paso de la etapa. El agujero de la aguja es similar a una apertura de campo rectangular y se puede utilizar en aplicaciones que requieren campos de iluminación de altura limitada.

Otros accesorios incluyen adaptadores de carcasa de Doble luz que permiten conectar simultáneamente dos fuentes de luz, como mercurio y lámparas de descarga de arco de xenón, al iluminador vertical. Los iluminadores adecuados para estimular láseres también se pueden utilizar en aplicaciones como la fluorescencia de reflexión interna total (tirf), el microscopio de imagen de vida útil fluorescente (flim), la imagen de tasa y los experimentos de recuperación de fotoblanqueamiento. Además, la mayoría de los microscopios fluorescentes de grado de investigación proporcionados por los principales fabricantes se adaptan fácilmente a sus respectivos accesorios de enfoque común de escaneo láser. El microscopio vertical recibe la unidad de escaneo confocal a través de un tubo de Observación de tres ojos, mientras que el instrumento invertido puede conectar el escáner de haz de luz al lado o al puerto trasero del marco del microscopio. El doble puerto insertado entre el iluminador vertical y el tubo de observación se puede utilizar para introducir fuentes de luz adicionales o para guiar la fluorescencia a más de un detector. La mayoría de estos dispositivos están equipados con adaptadores opcionales de montaje tipo C o accesorios de Puerto de microscopio estándar.

Los microscopios fluorescentes diseñados para la investigación en electrofisiología se han vuelto muy complejos. Muchos están equipados con niveles de amortiguación especializados que pueden aceptar una variedad de accesorios de microactuador para el uso de fluorescencia, experimentos de contraste de interferencia diferencial infrarroja (ir - tic) y técnicas tradicionales de imagen de mejora de contraste de campo brillante. El disco giratorio de la lente animal oscilante permite un intercambio rápido y sin vibraciones de la lente para evitar la interferencia con la invasión de especímenes o burbujas en la imagen de células y tejidos vivos. Las observaciones macroscópicas fluorescentes se pueden realizar en organismos vivos utilizando nuevas lentes de macrodistancia 2x y 4x de larga distancia de trabajo de apertura numérica alta (lentes objetivo), equipadas con combinaciones especializadas de filtros. Además, algunos fabricantes ofrecen iluminadores verticales fluorescentes y bancos de filtros como accesorios para sus microscopios estereoscópicos.

Los iluminadores verticales a veces pueden optar por una ampliación de 1,25 a 1,5 veces como opción, pero debido a los problemas inherentes a la introducción de la ampliación vacía, el uso de lentes auxiliares para entrar en imágenes fluorescentes debe evitarse en la medida de lo posible. Varios diseños de iluminadores verticales modulares incluyen dispositivos para conectar módulos de divisores de haz incluidos en varios puertos de cámara por encima de los iluminadores para aumentar la capacidad de imagen. Teniendo en cuenta los diversos accesorios eléctricos que ahora están disponibles para microscopios fluorescentes, incluyendo discos giratorios de lentes, focos, ruedas de filtro y plataformas, los investigadores pueden obtener técnicas de imagen más complejas que nunca. Los fabricantes han invertido mucha energía en el diseño de accesorios para muchas aplicaciones fluorescentes complejas, que una vez solo pudieron usar microscopios construidos con piezas de diversas fuentes. A medida que el microscopio fluorescente se convierte en una herramienta cada vez más importante en el campo de la biología celular, la Neurofisiología y la clínica

Diseño del microscopio fluorescente invertido

Una versión similar del iluminador fluorescente vertical se puede utilizar para invertir el Stent del microscopio (cultivo de tejidos). El Stent invertido también permite la combinación o alternancia entre diversas técnicas de mejora del contraste de microscopía de fluorescencia de luz reflejada y transmisión. El microscopio invertido de nivel de investigación tiene múltiples (seis más) puertos de entrada / salida, generalmente con un solo puerto a cada lado del marco, y uno o dos puertos en la parte trasera (superior e inferior) y un microscopio de Puerto inferior debajo de la parte inferior, en algunos modelos, permite obtener la imagen principal simultáneamente de tres o más puertos sin Necesidad de usar lentes de retransmisión. Este nivel de conexión permite realizar complejos análisis de fluorescencia utilizando múltiples fuentes de luz, filtros y sistemas de cámaras. Las tapas de mercurio y xenón para microscopios invertidos se pueden utilizar junto con lentes de enfoque multicomponentes o asféricas estándar para mejorar el rendimiento y reducir las distorsiones en las regiones espectrales ultravioleta e infrarroja. Además, se pueden utilizar varios adaptadores de caja de luz para conectar múltiples fuentes de iluminación, similares a los accesorios que se pueden utilizar para microscopios verticales.

La figura 10 muestra un diagrama esquemático del perfil del moderno microscopio fluorescente invertido (cultivo de tejidos), equipado con un sensor de imagen CC enfriado por Peltier y un sistema tradicional de cámaras de película de 35 mm. Aunque la películacámaraEl uso es limitado, pero la mayoría de los microscopios invertidos todavía incluyen puertos para estos accesorios en la parte inferior de la base delantera. El microscopio que se muestra en la figura 10 puede utilizar una caja de luz tungsteno - halógeno instalada en un pilar para realizar la iluminación tradicional de transmisión de campo brillante (con o sin mejora de contraste). Las lámparas de descarga de arco de mercurio o xenón se utilizan para microscopios fluorescentes, utilizando iluminadores reflectantes conectados a puertos traseros especialmente configurados. Las aperturas y las aperturas de campo, así como los filtros de densidad neutra, entran cerca del puerto en la parte posterior del microscopio. En algunos modelos de microscopía invertida (no mostrados), Los iluminadores reflectantes en forma de l que contienen diafragmas centrables pueden utilizarse para mejorar el acceso a los puertos auxiliares traseros para accesorios adicionales. En la figura 10, el camino de luz a través del microscopio indica la luz transmitida en amarillo, el morado indica la iluminación del arco sin filtrar, el verde indica la excitación de fluorescencia filtrada y la luz roja indica la emisión de fluorescencia.

Los modernos marcos de microscopía invertida, como sus homólogos erguidos, son materiales compuestos diseñados y fabricados por computadora para su estabilidad estructural y térmica. Además, los componentes de la plataforma mecánica y la estructura del circuito están diseñados para tener distancias de recorrido cortas y alta rigidez para evitar la inclinación y la desviación al manipular el volante de la lente en operaciones convencionales como la inserción de prismas TIC TIC o el ajuste del anillo de corrección de la lente. La etapa avanzada de la plataforma giratoria de la lente objetivo puede eliminar efectivamente la deriva del foco en la observación fluorescente tardía y prolongada. Otras opciones de escenario que no tiene el microscopio vertical estándar son escenario deslizante y giratorio de 360 grados, tablero de escenario de vidrio, tablero de calentamiento, soporte de placa de Petri y tablero y incubadora de dióxido de carbono.

Los microscopios invertidos con un diseño modular se pueden configurar fácilmente para el estudio de la electrofisiología, la fecundación in vitro, la micromanipulación, el dic de alta resolución, la observación de mejora de vídeo y diversas técnicas avanzadas de fluorescencia. Estos instrumentos también son fáciles de aplicar a microscopios confocales y multiphotones. Los accesorios eléctricos incluyen persianas, ruedas filtrantes, discos giratorios de lentes objetivo, discos giratorios de bloques fluorescentes, accionamientos de enfoque y focos. Cuando se combina con objetivos avanzados de alta distancia de trabajo, inmersión en agua, excitación ultravioleta y contraste de fase, todo tiene un alto grado de corrección óptica, y el microscopio invertido es el instrumento ideal para realizar estudios de fluorescencia de células vivas y tejidos.

conclusión

En el microscopio fluorescente, los cambios generalizados entre las concentraciones de grupos fluorescentes locales en la muestra, junto con las diferencias en el coeficiente de extinción y el rendimiento cuántico de un tinte fluorescente a otro, influyen significativamente en las señales de emisión generadas para la intensidad de excitación cuantitativa. Teniendo en cuenta que muchas muestras contienen solo trazas de material fluorescente en cualquier campo de visión específico, estos factores combinados producen niveles medios de emisión de fluorescencia de 4 a 6 órdenes de magnitud menos que la intensidad de excitación. Además, hay técnicas de fluorescencia más complejas, como la hibridación in situ y la transferencia de energía de resonancia (fret), que pueden tener una intensidad de señal de emisión de 9 a 10 órdenes de magnitud menor que la intensidad de señal de emisión estimulada. Para compensar estas grandes diferencias entre la intensidad de excitación y la intensidad de emisión, los microscopios fluorescentes modernos deben ser capaces de atenuar la radiación de excitación más de mil millones de veces sin interferir con las señales fluorescentes.

Una de las principales características del microscopio fluorescente es la alta especificidad de las sondas fluorescentes que absorben y emiten luz en longitudes de onda características, lo que hace que la tecnología sea capaz de detectar selectivamente especies objetivo en una mezcla compleja a concentraciones muy bajas. Además, la alta sensibilidad y resolución espacial de la fluorescencia permiten localizar y estudiar con precisión moléculas individuales a escalas de longitud por debajo de la resolución óptica del microscopio. Los factores ambientales locales también afectan gravemente la emisión de fluorescencia, por lo que el método es una sonda ideal para fluctuaciones de ph, viscosidad, concentración de iones, distancia molecular y orientación, potencial de membrana, hidrofobicidad, distribución de carga y coeficiente de difusión. La resolución temporal de la fluorescencia se limita a la vida útil de la sonda fluorescente estimulada, que puede ser de nanosegundos. Debido a que muchos procesos biológicos ocurren en este dominio del tiempo, la dinámica de desintegración puede revelar información dinámica sobre los procesos celulares. En general, estos factores son esenciales en la aplicación de la microscopía fluorescente a la biología celular.

En la última década, los microscopios fluorescentes se han desarrollado a un ritmo alarmante, al tiempo que se han desarrollado igualmente rápidamente en tecnología láser, detectores de Estado sólido, fabricación de películas de interferencia y análisis de imágenes basados en computadoras. El desarrollo de lentes de inmersión en agua de apertura numérica alta ha contribuido aún más a la investigación de fenómenos biológicos, permitiendo a los investigadores detectar células vivas en profundidad en su entorno natural. A medida que los fabricantes de microscopios respondan a las cambiantes necesidades de la comunidad de investigación, el desarrollo de instrumentos y accesorios fluorescentes avanzados sin duda continuará desarrollándose, y su contribución final a la exploración del misterio natural puede terminar siendo de gran alcance.