El sintético de ácidos nucleicos es el equipo central de la investigación y el desarrollo de la biología molecular moderna, la genómica y la biomedicina, y puede sintetizar ADN o rnaoligonucleotide (oligonucleótido) de secuencias específicas de manera eficiente y precisa in vitro.Sus principios técnicos integran la tecnología de síntesis de fase sólida, la química orgánica y el control automatizado de precisión, logrando la "compilación bajo demanda" del código genético de la vida.

　　I. principios básicos: método químico de fosfamida de fase sólida

En la actualidad, las principales tecnologías de síntesis de ácidos nucleicos se basan en el principio de síntesis de fase sólida, y su núcleo es el método químico de fosfoimida. Este método tiene las características de alta eficiencia, alto rendimiento y fácil automatización, reemplazando los primeros métodos de fosfodiéster y fosfodiéster. Todo el proceso de síntesis se lleva a cabo en la columna sintética del instrumento, y la dirección de síntesis de la cadena objetivo es de 3 'extremo a 5' extremo.

Un ciclo de síntesis incluye principalmente cuatro pasos básicos:

1. protección:

La síntesis comienza con el primer nucleótido Unido covalentemente al portador sólido. El 5 '- hidroxi del nucleótido está bloqueado por un grupo protector. El primer paso del ciclo es lavar la columna sintética con una solución ácida, quitar el Grupo protector DMT en el extremo 5 'del primer nucleótido y exponer el 5' - hidroxi activo para prepararse para la siguiente reacción de acoplamiento. El catión DMT retirado es naranja y puede monitorear la eficiencia de la síntesis en línea a través de la fotometría.

2. activación y acoplamiento:

A continuación, el instrumento bombea simultáneamente el siguiente monómeros de nucleótidos y el promotor a conectar en la columna sintética. Los monómeros de nucleótidos en sí están altamente activados, y su extremo 3 'está protegido por el Grupo fosfoimina, mientras que el extremo 5' está protegido por dmt, y también hay el Grupo protector correspondiente en la base.

El promotor activará el Grupo de fosfato imino de 3 'de los monómeros de nucleótidos para convertirlo en un buen reactivo electrophilic. Posteriormente, se produce rápidamente una reacción de Sustitución nucleófila con el 5 '- hidroxi expuesto en el portador sólido, formando un enlace trifosfato, agregando así nuevos nucleótidos a la cadena de oligonucleótidos que se está extendiendo.

3. tapas:

Los pasos de acoplamiento no son 100% efectivos y siempre hay muy pocas cadenas de 5 '- hidroxi que no participan en la reacción. Estas secuencias fallidas, si no están cerradas, continuarán participando en la reacción en ciclos posteriores, produciendo subproductos de las secuencias faltantes.

El paso del "tapón" utiliza una mezcla de dos reactivos para acetar y sellar el 5 '- hidroxi no reaccionado, inactivando permanentemente. Estas cadenas cortas "tapadas" se eliminan en la purificación final, lo que mejora enormemente la corrección de la secuencia y la pureza del producto final.

4. oxidación:

El siguiente paso de acoplamiento formó un enlace inestable de fosfito de trietilo, que es fácil de descomponer por ácido. En este paso, se introduce una solución mixta de yodo / agua / piridina para oxidarla en un enlace de fosfato de trietilo más estable, completando así un ciclo completo de adición de nucleótidos.

Desde entonces, el instrumento repite automáticamente los cuatro pasos anteriores de "desprotección → acoplamiento → tapa → oxidación", agregando un nuevo nucleótido a cada ciclo hasta que se sintetice toda la secuencia objetivo.

　　II. tratamiento posterior a la síntesis

Después de que el sintético de ácido nucleico completó el montaje de la cadena, el producto resultante sigue siendo un producto grueso de ADN conectado a un portador sólido y todos los grupos están protegidos. Por lo tanto, es necesario hacer un seguimiento:

1. Corte y desprotección: tratamiento con solución de amoníaco concentrado, por un lado, cortando las cadenas de oligonucleótidos sintetizadas del portador CPG y, por otro lado, eliminando simultáneamente los grupos protectores en todas las bases y los grupos DMT al final de la cadena.

2. purificación: de acuerdo con las necesidades de la aplicación, se puede purificar a través de la Cromatografía líquida de alto rendimiento (clar) o la página, entre otras cosas, para eliminar secuencias y subproductos fallidos y obtener productos finales de alta pureza.

　　III. Resumen

La esencia del sintético de ácidos nucleicos es un reactor químico orgánico de precisión altamente automatizado. Logra una síntesis rápida, de alto rendimiento y precisa de ADN / rnaoligonucleotide descomponiendo complejas reacciones químicas sintéticas en una serie de pasos estandarizados controlables programáticamente y controlando con precisión el flujo de líquido, la cantidad de reactivos y el tiempo de reacción por computadora. La madurez y popularización de esta tecnología ha promovido en gran medida el rápido desarrollo de tecnologías de vanguardia como la edición genética, la detección pcr, los medicamentos de ácido nucleico y el almacenamiento de adn.