Sobre la caracterización del EV
La estimación del número de ev, la determinación de la presencia de ev y la evaluación de la participación y el impacto de los componentes no EV en la preparación de EV requieren la caracterización de ev. La caracterización del EV se enfrenta a los desafíos del tamaño de las partículas pequeñas, la heterogeneidad de tamaño y la heterogeneidad molecular, la falta de métodos generales de reconocimiento del ev y la especificidad no EV de muchas técnicas de medición.Ninguna de las mediciones o métodos cumple con los requisitos de todas las caracterizaciones de ev, por lo que se recomienda verificar entre sí utilizando métodos ortonormales (es decir, métodos sin las mismas restricciones de medición).Es decir, los parámetros característicos del EV como atributos de calidad clave (cqa) recomiendan el uso de dos o más principios diferentes para detectar el mismo indicador.
La composición general del EV (contenido y proporción de proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y otras biomoléculas, etc.) varía según el origen del ev. Aunque estas mediciones de una sola categoría molecular se pueden utilizar para estimar la abundancia de ev, estos valores no están necesariamente relacionados con todas las concentraciones de ev, y no hay universalidad entre los materiales de origen; Por lo tanto,No deben utilizarse como medida de la concentración de ev.Así como no hay detección de una sola molécula que pueda cuantificar todos los ev, tampoco hay marcadores moleculares universales de eV o subtipos de ev. Los marcadores específicos deben seleccionarse en función de la evidencia de la especificidad de la fuente y la especificidad del tipo. En la actualidad,No existe una marca universal conocida que reconozca todos los ev, independientemente de su origen.Para los llamados exocrinos, la prevalencia de estos marcadores no está clara o no es aceptada. Tenga en cuenta que los protocolos basados en la afinidad que involucran las proteínas de membrana cruzada cuádruple cd9, cd63 y cd81 no son específicos para los exocrinos como subtipos ev; El uso de grupos de EV enriquecidos con anticuerpos contra una de estas cuatro proteínas de membrana cruzada no puede cubrir de manera incompleta toda la composición molecular. Además, no todos los evs expresan estos marcadores de proteínas, por lo que cuatro concentraciones de proteínas de membrana cruzada no capturan todos los evs.Método ortogonal para detectar el mismo parámetro de caracterización(método de más de un principio)Es poco probable que haya la misma desviación; Por ejemplo, al mismo tiempo, el diámetro del EV se deduce y detecta por métodos ópticos y no ópticos, respectivamente.La caracterización de muestras de EV utilizando métodos ortográficos también es crucial para demostrar que los coproductos no tienen nada que ver con biomarcadores o descubrimientos funcionales.Debido a que muchos métodos de caracterización de EV no son específicos para eV o no pueden detectar todos los ev, es necesario publicar los métodos y resultados de manera transparente para garantizar la repetibilidad de los datos de ev.
I. cuantificación de la concentración de partículas
La cantidad de ev, junto con la medición del volumen, define la concentración numérica (en unidades de partículas / ml), un indicador ampliamente reportado y utilizado. Sin embargo, generalmente no es confiable porque muchas tecnologías carecen de especificidad para el ev y sensibilidad a todos los ev.El Grupo de trabajo de materiales de referencia EV estrictos y estandarizados del isev esbozó recientemente las consideraciones de las técnicas de medición y los desafíos que enfrenta este campo para enfrentar materiales de referencia EV bien caracterizados por mediciones trazables, desarrollo e informes. Uno de los aspectos clave de este trabajo es la necesidad de publicar el Lod del método de detección, permitiendo así a otros verificar los resultados, independientemente del límite de sensibilidad.La credibilidad de la medición de la concentración de EV se puede mejorar mediante el uso de métodos ortonormales.，Cada método tiene un Lod determinado, como la detección de la intensidad de dispersión de la luz(por ejemplo, nta), intensidad de fluorescencia(por ejemplo, fcm)Y tamaño físico(por ejemplo, rps,Porque el método de cuadratura no tiene las mismas restricciones de medición. por ejemplo, la tecnología de inducción de pulso de Resistencia (rps) puede representar Lod en términos de tamaño de partícula. Para técnicas ópticas como la medición en flujo, el Lod se puede reportar con un diámetro derivado de un modelo óptico de dispersión de la luz o moléculas equivalentes de fluorescencia soluble (mesf) derivadas de una intensidad de fluorescencia. Estos métodos pueden generar datos consistentes entre diferentes instrumentos y sensibilidades. Debido a que la detección de partículas implica más variables, por lo queActualmente no hay métodos para el análisis de seguimiento de nanopartículas (nta), la dispersión dinámica de la luz (dls)(...)O la citología de flujo de imágenes produce un Lod trazable.En el caso de las tecnologías que no distinguen entre ev y otros posibles coproductores o contaminantes, se recomienda que el informe de concentración se exprese como "concentración de partículas o concentración de ep" en lugar de "concentración de ev", independientemente de los pasos de separación aguas arriba.
II. cuantificación del tamaño de las partículas
Las mediciones del tamaño del EV (en nanoradio o diámetro) dependen de supuestos como la esfericidad o la movilidad, y los resultados de salida pueden verse afectados por variables aguas arriba. Métodos comunes de alto rendimiento, incluida la medición en flujo, NTA、RPS、 Tanto la dispersión de la luz multiángulo como la dispersión dinámica de la luz (dls) asumen que EV es esférico. Aunque el "tamaño" y el "diámetro" a menudo se utilizan entre métodos de medición, su derivación también puede conducir a diferencias consistentes entre las técnicas de medición. Por ejemplo,Las técnicas que dependen del Movimiento marrón de las partículas (como NTA o dls) miden el diámetro hidrodinámico, lo que puede provocar una estimación excesiva del tamaño de las partículas en comparación con métodos de imagen como la microscopía crioelectrónica.Y hay pocas maneras de medir con precisión el tamaño del EV en todo el rango de diámetro posible del EV (de decenas de nanómetros a micras). Por ejemplo, aunque la imagen de alta resolución de la microscopía crioelectrónica es uno de los métodos más precisos, su flujo de detección es relativamente bajo y muchos EV más grandes tienden a ser menos numerosos y pueden no ser cuantificables. La capacidad de cuantificar EV de bajo contraste por debajo de 100 nm también puede ser un factor restrictivo.
A medida que más y más investigadores utilizan técnicas especializadas de análisis de partículas únicas con mayor sensibilidad, cada vez está más claro que muchas preparaciones de EV muestran una distribución asimétrica a la derecha, como la distribución normal logarítmica, en la que la mayoría de EV tienen un diámetro inferior a 100 nm. la mayoría de las técnicas de análisis de partículas únicas no pueden analizar todos los grupos de ev, por lo queLos investigadores deben compartir la distribución del diámetro del EV detectado，Y no solo indicadores agregados como el tamaño promedio, el tamaño concentrado o el tamaño medianoEstos indicadores se inclinan fácilmente debido a la LOD y la distribución asimétrica del tamaño. Atención por favor.Las estadísticas de tamaño de ajuste, como la medición de partículas de bajo índice de refracción a través de nta, pueden estar más cerca del Lod del instrumento que del diámetro modo real del Grupo ev.La tecnología que utiliza software con algoritmos propios para determinar el tamaño de las partículas también puede causar diferencias entre versiones de software o plataformas de software, por lo que también debe proporcionar software y sus versiones.Las técnicas para deducir el tamaño a partir de la hipótesis del índice de refracción pueden variar debido a la composición diferente de la muestra y la carga.. El tamaño derivado de las sondas fluorescentes (por ejemplo, los tintes de incrustación de membrana) puede variar debido a la incrustación de diferentes tintes basados es es en diferentes componentes lipídicos de membrana. En el caso de las técnicas que no distinguen entre ev y coproducción / contaminante, se recomienda que el informe de diámetro se exprese como diámetro "de partícula" o "ep", independientemente de los pasos de separación aguas arriba, en lugar de "diámetro de ev".
III. precauciones para el informe específico de la tecnología de caracterización EV
Con el uso de experimentos e instrumentos de detección ev y la expansión del conocimiento experto, la determinación de la escala de informes de caracterización relevantes también está aumentando para garantizar la fiabilidad y repetibilidad de los datos. La Guía misev2023 detalla una lista de precauciones para los informes específicos de experimentos e instrumentos mínimos. Estos suelen ser aplicables independientemente del diseño experimental. Las tecnologías enumeradas aquí no son exhaustivas, muchas tecnologías de detección se están desarrollando o estudiando activamente. Sin embargo, las técnicas enumeradas están disponibles comercialmente y hay documentos publicados de varios investigadores. (debido a las limitaciones de espacio, el autor solo enumera aquí las descripciones y los principales puntos de vista de varias herramientas comunes para la caracterización del tamaño y la concentración de partículas ev)[citología de flujo basada en microcuentas]El isev recomienda que el Grupo de control incluya anticuerpos del mismo tipo como anticuerpos de detección, o microcuentas de captura acopladas al mismo tipo, y microcuentas de captura que solo contengan anticuerpos de detección (para perlas de captura envueltas en paquetes de anticuerpos); Se deben utilizar varias concentraciones de muestra de EV para mostrar la titulación de la señal; Si se preparan microcuentas, se deben publicar sus reactivos e ingredientes químicos; También deben publicarse el catálogo y el número de lote de los reactivos de captura comercial de microcuentas; Publicar el valor de intensidad de fluorescencia mediana de las microcuentas estandarizadas; Publicar datos y estadísticas de intensidad de fluorescencia mediana de moléculas de fluorescencia soluble equivalente (mesf) de microcuentas delimitadas en un solo Estado (al igual que la medición en flujo de EV único); Se debe publicar una metodología completa y detallada.[citología de flujo EV único]En 2023, a través de la iniciativa del Grupo de trabajo de las tres sociedades (grupo de trabajo de citología de flujo ev), compuesto por la sociedad internacional de vesículas extracelulares (isev), la sociedad internacional para el progreso del recuento celular y la sociedad internacional de trombosis y hemostasia, se publicó el esquema de citología de flujo EV único para resolver de manera integral Las precauciones en el desarrollo de pruebas de citología de flujo EV único.La calibración de los parámetros de volumen de la muestra, fluorescencia y dispersión de la luz es crucial para la interpretación y reproducción de los resultados de flujo de un solo ev. Si se utiliza un citometro de flujo EV único para informar la concentración de partículas, determine el límite superior e inferior del Lod para permitir el uso de métodos ortonormales u otras personas para repetir y verificar el resultado.En la actualidad, el citometro de imagen utiliza el método de activación dinámica, lo que dificulta la definición de Lod más bajo y, por lo tanto, la estandarización.[dispersión dinámica de la luz]DLS， También conocido como espectro de correlación fotónica (pcs) y dispersión de luz cuasielástica (qels), es una tecnología capaz de determinar el diámetro hidrodinámico de partículas completamente monodispersas en una dispersión de solución de agua diluida. Dls mide la función de Autocorrelación de la intensidad láser dispersa por múltiples partículas en la solución. La función de Autocorrelación lleva información sobre el coeficiente de difusión de partículas, que está relacionado con el diámetro hidrodinámico a través de la teoría del Movimiento Stokes - Einstein brown.Se pueden utilizar varios algoritmos para deducir el coeficiente de difusión de la función de Autocorrelación medida. El método más común es el análisis acumulativo, peroAsume que las muestras son una distribución de tamaño monodispersa, y las muestras EV no tienen esta distribución.Para la distribución del tamaño multidisperso de las muestras ev, la distribución del coeficiente de la función de Autocorrelación derivada de la difusión se ha convertido en un problema matemático incómodo. Esto significaDls no se aplica para determinar las propiedades cuantitativas de las muestras de EVA menos que el dls se aplique a una parte del EV con un tamaño monodisperso. Por otro lado, el dls puede utilizarse para confirmar cualitativamente la posible presencia de partículas submicron y posibles agregados en muestras ev.[microscopio electrónico]Varios microscopios electrónicos (em) son una de las pocas tecnologías capaces de detectar EV (independientemente de su tamaño). Sin embargo, el flujo de la microscopía electrónica también significa que los evs más grandes se subestimarán estadísticamente en comparación con los evs más pequeños. Sem, tem y cryo - em son métodos de caracterización EV de alta resolución, y no tienen que cambiar entre sí o pueden proporcionar imágenes de calidad comparable. Por ejemplo,El Crio - em puede mostrar claramente la estructura bilayer lipídica, manteniendo mejor la morfología EV que las condiciones de deshidratación utilizadas por el tem para fijar la muestra y puede ser más preciso y cuantitativo (tamaño),Porque todas las partículas en un cierto volumen pueden ser fotografiadas, no solo aquellas que se adhieren a la superficie de la red.Los estudios de estandarización de los métodos em para determinar los bajos requisitos de presentación de informes son muy limitados. Para el tem, se deben publicar tres parámetros principales: métodos de fijación, adsorción y teñido negativo. La fijación incluye: el agente de fijación utilizado y su concentración y tiempo de incubación; La adsorción incluye materiales de carga de red, tamaño de carga de red, tipo de película, recubrimiento, tiempo de incubación y detalles de limpieza; Los detalles de la Tinción negativa deben incluir el sustrato, la concentración y el tiempo de incubación. Además, se deben publicar imágenes de baja y alta potencia, así como criterios de selección de imágenes.[análisis de seguimiento de nanopartículas]NTA， También se considera un seguimiento de una sola partícula, una tecnología óptica ampliamente utilizada en el campo de EV para estimar el tamaño y la concentración de partículas. La NTA suele utilizar algoritmos para reducir los cambios en la distribución del diámetro para obtener el diámetro hidrodinámico midiendo el coeficiente de difusión de las partículas. Cabe señalar que,El algoritmo ftla utilizado en algunos dispositivos NTA se ha desarrollado para representar mejor las mezclas monodispersas, mientras que el EV no lo es, lo que puede conducir a una distribución artificial de múltiples ajustes.. además, actualmente no hay forma de determinar o publicar el Lod establecido por la nta. Muchos estudiosos han llevado a cabo varios estudios estandarizados para comparar los resultados entre usuarios e instrumentos.El uso de la NTA para medir la distribución del diámetro y la concentración de muestras de fluidos biológicos complejos debe explicarse con precaución.Porque cuenta coproductores como las apolipoproteínas y los grandes complejos proteicos, yNTA tiene dificultades para cuantificar el EV con un diámetro de más de cientos de nanómetros.Para la información publicada por nta, debe incluir el modelo del instrumento, el tipo de cámara, la configuración de la cámara, la longitud de onda láser, la Potencia láser, la versión del software, la configuración de análisis y las partículas por cuadro. Si se conoce, entoncesDeberían publicarse los algoritmos utilizados para generar la distribución del diámetro, ya que pueden producirse resultados diferentes en función de los algoritmos utilizados.En el caso de los modos de dispersión de la luz o detección por fluorescencia, se recomienda utilizar un amortiguador en blanco como control. En el caso de la NTA fluorescente, se informa del número total de partículas en el modo de dispersión de la luz y del número de partículas marcadas en el modo de fluorescencia, así como del método de eliminación de marcas y el control del amortiguador / reactivo para evaluar la situación de pseudo - color de la marca.Si se utiliza el dispositivo de muestra de líquido, también se debe anunciar su configuración..[inducción de pulso de resistencia]Esta es la primera vez que el misev utiliza la tecnología de inducción de pulso de Resistencia (rps) como un método de caracterización de partículas EV comúnmente recomendado junto con métodos basados en flujo (incluidos flujos basados en microcuentas y flujos EV únicos) y métodos basados es es en microscopía (incluidos microscopía de fuerza atómica, microscopía electrónica, dls, nta, microscopía de superresolución, etc.). También es una de las pocas técnicas de caracterización EV de principios no ópticos.El RPS utiliza el principio Kurt para determinar la concentración y el diámetro de las partículas, y algunos equipos también tienen la función de potencial zeta. En la actualidad, el diámetro del rps, lod, es tan bajo como ~ 50 nm. la literatura informa,RPSLos resultados de la medición son realmente relevantes.TEMLos datos tienen una consistencia muy alta.Al informar sobre los datos del rps, se recomienda publicar el modelo del instrumento, el diámetro del agujero, el diámetro y el origen de las cuentas calibradas y la versión del software. Como se mencionó anteriormente (cuantificación del tamaño de las partículas), para los datos de ev,Se recomienda publicar la distribución del diámetro de los RPS en lugar de las estadísticas de un solo diámetro. Y se recomienda incluir una comparación de amortiguadores en blanco para identificar el Fondo, así como muestras agrietadas con la misma concentración de descontaminante para determinar el evento marcado. Debido a que la tecnología rps es fácil de bloquear por partículas más grandes, se pueden usar pasos previos al análisis como centrifugación o filtración para eliminar partículas más grandes. Dado que estos métodos pueden alterar el Grupo de EV que se está analizando e influir en la comparación con el método ortogonal, debe especificarse cualquier preprocesador de análisis.[método de impresión de proteínas]Es necesario proporcionar detalles sobre el enriquecimiento y la cuantificación de proteínas; Si es posible, debe incluir controles positivos y negativos del antígeno; Si se afirma que la proteína está relacionada con el ev, es necesario incluir la medición de la pureza del preparado ev. Informar sobre todos los detalles de la estandarización de la muestra, la gel, el método de transferencia de membrana, la sonda y la imagen / análisis (incluyendo, pero no limitado a, información de anticuerpos, las condiciones de desnaturalización y reducción de la muestra, el método de transferencia de membrana, el tipo de membrana, El amortiguador y el equipo y parámetros de imagen); Proporcionar todas las imágenes sin cortar de BM (si se publican en la revista, deben usarse como información complementaria).En los capítulos anteriores, la Guía discute diferentes métodos de caracterización del ev y proporciona recomendaciones específicas. Independientemente del método utilizado, las recomendaciones generales para la caracterización se resumen de la siguiente manera:
- Cada preparado de EV debe definirse mediante una medición cuantitativa del origen del EV (por ejemplo, el número de células secretadas, el volumen de fluidos biológicos, la masa del tejido, etc.).
- Se debe estimar la abundancia de EV (incluyendo el número de partículas, el contenido de proteínas y / o lípidos).
- Se debe detectar la presencia de componentes relacionados con el subtipo de eV o EV en el preparado de ev, dependiendo de la especificidad necesaria para el propósito experimental.
- Determinar el grado de presencia de componentes no vesículos y coescritos.
- Al utilizar indicadores cuantitativos para caracterizar el ev, es necesario proporcionar un límite de detección (lod) de instrumento o método.
