En el sistema de detección del analizador de aminoácidos, la derivación posterior a la columna es un paso clave para convertir los aminoácidos separados por la columna cromatográfica en derivados que se pueden detectar con alta sensibilidad, mientras que la detección por fluorescencia es el medio central para lograr el análisis cuantitativo de aminoácidos capturando señales fluorescentes de los derivados. La combinación de los dos puede resolver el problema de que "la señal de fluorescencia de los aminoácidos libres en sí es débil y es difícil de detectar directamente con alta sensibilidad". es la combinación tecnológica principal del análisis moderno de aminoácidos (especialmente el análisis de trazas). su principio se puede desmontar en dos partes: "mecanismo de reacción de derivación posterior a la columna" y "principio óptico de detección fluorescente", que son las siguientes:
I. principios de la derivación posterior a la columna: transformar "aminoácidos difíciles de detectar" en "derivados fáciles de detectar"
Las moléculas de aminoácidos (excepto el triptófano) en sí carecen de una fuerte absorción ultravioleta o grupos emisores fluorescentes, y la sensibilidad es extremadamente baja en la detección directa (no puede satisfacer las necesidades de análisis de trazas de grado μg / l). La lógica central de la derivación posterior a la columna es que los aminoácidos separados por una columna de intercambio de iones (modo de separación comúnmente utilizado en el análisis de aminoácidos) reaccionan químicamente con un "reactivo derivado" específico después de la columna de salida para generar derivados estables con fuerte fluorescencia (o fuerte absorción ultravioleta), creando las condiciones para la detección posterior de alta sensibilidad.
1. proceso central: separación → mezcla → reacción → detección
El sistema de derivación posterior a la columna consta de "tanque de almacenamiento de reactivos derivados, mezclador, bobina de reacción y dispositivo de control de temperatura", los pasos específicos son:
Separación de aminoácidos: una variedad de aminoácidos en la muestra se separan a través de columnas de intercambio de iones (como la resina de intercambio de iones sulfónicos), que salen de la columna en un orden específico debido a las diferencias de afinidad entre los diferentes aminoácidos y la resina;
Mezcla de reactivos: el flujo de aminoácidos después de la separación (fase móvil + aminoácidos) se mezcla completamente con el flujo de reactivos derivados (como indenona, OPA de o - benzalaldehído, fmoc de cloroformo de 9 - fluoreno) a través de un "mezclador en forma de t";
Reacción a temperatura constante: la mezcla entra en el "tubo de reacción de control de temperatura" (generalmente 30 - 130 ° c, dependiendo del reactivo), y la reacción derivada se produce a una temperatura específica para generar derivados fluorescentes;
Detección de entrada: el derivado reaccionado fluye directamente al detector de fluorescencia para la captura de señales.
II. principios de la detección por fluorescencia: capturar la señal fluorescente de los derivados y realizar análisis cuantitativos
La detección de fluorescencia se basa en el fenómeno de la "fotoluminiscencia": cuando un derivado fluorescente es iluminado por una longitud de onda específica de luz (luminiscencia intensa), la energía absorbida por los electrones en la molécula salta al nivel de alta energía, y luego libera parte de la energía a través de una transición no radiante, y luego salta de nuevo al Estado del suelo y emite una longitud de onda específica de luz (fluorescencia). El detector de fluorescencia convierte la intensidad de la fluorescencia en señales eléctricas a través de "filtración de luz estimulada, recolección de fluorescencia y conversión de señales", y finalmente realiza el análisis cuantitativo de aminoácidos.
1. estructura central y flujo de trabajo del detector fluorescente
El detector de fluorescencia se compone principalmente de "fuente de luz, monocromador de excitación, piscina de muestras, monocromador de emisión, tubo Fotomultiplicador (pmt), procesador de señal", los pasos específicos son los siguientes:
Producción de luz estimulada: la luz compuesta emitida por una fuente de luz (lámpara de xenón de uso común, que puede proporcionar un espectro continuo de 200 - 800 nm), filtrada por un "monocromador estimulado" (compuesto por rejillas y ranuras), conserva solo la luz monocromática que coincide con la "longitud de onda estimulada" del derivado (por ejemplo, el derivado OPA corresponde a la luminiscencia estimulada a 340 nm);
Excitación y emisión de fluorescencia: la luz estimulada pasa por la piscina de muestras (fluye a través de la solución derivada derivada detrás de la columna), y la molécula derivada emite fluorescencia después de absorber la energía (la dirección de fluorescencia es vertical a la luz estimulada para evitar interferencias de luminiscencia);
Filtración y recogida de fluorescencia: la fluorescencia emitida se filtra por un "monocromador emisor" (eliminando la luz Miscelánea y la luminiscencia no absorbida), conservando solo la luz monocromática que coincide con la "longitud de onda emisora" del derivado (por ejemplo, el derivado OPA corresponde a la luz emitida a 450 nm);
Conversión y cuantificación de la señal: la fluorescencia filtrada es recibida por el "tubo Fotomultiplicador (pmt)", que convierte la señal óptica débil en una señal eléctrica proporcional (corriente o voltaje), y luego se amplifica por el procesador de señal y se convierte analógico a digital para generar un espectro de color de "intensidad de fluorescencia - tiempo de retención";
Base cuantitativa: de acuerdo con la "forma de extensión de fluorescencia de la Ley Lambert - bier" - dentro de un cierto rango de concentración, la intensidad de fluorescencia de los derivados de fluorescencia es proporcional a la concentración de aminoácidos, y la concentración de cada aminoácidos en la muestra se puede calcular comparando la "intensidad de fluorescencia de los derivados de aminoácidos estándar (curva estándar)" con la "intensidad de fluorescencia de los derivados de la muestra".
2. ventajas centrales de la detección por fluorescencia: alta sensibilidad y alta especificidad
En comparación con la detección de absorción ultravioleta, la detección fluorescente tiene ventajas insustituibles en el análisis de aminoácidos, que también es la razón central por la que la derivación post - columna a menudo se combina con la detección fluorescente:
Alta sensibilidad: el límite de detección (lod) de la detección por fluorescencia puede alcanzar el nivel nmol / l o incluso pmol / L (1 - 3 órdenes de magnitud menos que la detección ultravioleta), y puede detectar trazas de aminoácidos en muestras biológicas (como sangre, orina) (como el aumento de trazas de aminoácidos debido a anomalías metabólicas);
Alta especificidad: solo se pueden detectar "derivados que pueden producir fluorescencia", mientras que la fase móvil, las impurezas (si no reaccionan con el reactivo derivado) casi no tienen señales fluorescentes, lo que puede evitar eficazmente la interferencia de picos extraños (como el análisis de aminoácidos después de la proteólisis en los alimentos, sin necesidad de un tratamiento previo complejo para eliminar impurezas);
Amplio rango lineal: dentro del rango de concentración de 10 a 10, la intensidad de fluorescencia tiene una buena relación lineal con la concentración de aminoácidos, que es adecuada para la cuantificación de muestras de diferentes contenidos (desde trazas hasta constantes).
3. la lógica colaborativa de la derivación posterior a la columna y la detección fluorescente (por qué debe combinarse)
La combinación de los dos resuelve perfectamente los puntos dolorosos de "separación - detección" de la detección de aminoácidos, formando un circuito cerrado:
Derivación después de la separación, evitando interferencias: la derivación después de la columna se realiza después de la separación de aminoácidos por la columna cromatográfica, y el reactivo derivado no reacciona con impurezas (como proteínas, sales) en la muestra (las impurezas han sido separadas por la columna o no tienen aminoácidos), evitando que "las impurezas derivadas afecten la separación" (la derivación antes de la Columna puede causar superposición de picos debido a la co - elución de los derivados con impurezas);
Después de la derivación, la fluorescencia mejora la sensibilidad: convertir "aminoácidos sin fluorescencia" en "derivados de fluorescencia fuerte" a través de la derivación, para que la detección de fluorescencia pueda capturar señales débiles y satisfacer las necesidades de análisis de trazas (como la detección precisa del espectro metabólico de aminoácidos en el diagnóstico clínico);
La señal está vinculada a la concentración para lograr la cuantificación: la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la concentración del derivado (es decir, la concentración original de aminoácidos), combinada con la curva estándar para cuantificar con precisión el contenido de cada aminoácidos, el resultado es muy repetitivo (rsd suele ser inferior al 2%).