I. introducción al sistema de expresión de Pichia pastoris

Como un sistema de expresión eucariota eficiente, el sistema de expresión Pichia pastoris tiene una amplia gama de campos de aplicación y ventajas obvias. En comparación con otros sistemas de expresión, el sistema de expresión Pichia pastoris tiene ventajas obvias. Tiene uno de los promotores actuales con un mecanismo de regulación fuerte y estricto, el promotor aox1 del gen de la alcoxidasa, lo que hace que la regulación de la expresión de genes exógenos sea más precisa y eficiente. Su alto nivel de expresión no sólo puede lograr la expresión celular, sino también la expresión secretora, lo que satisface en gran medida las necesidades de diferentes investigaciones y producción. El proceso de fermentación es maduro y fácil de ampliar, y ya tiene la capacidad de industrialización a gran escala y producción de alta densidad, lo que proporciona condiciones convenientes para el desarrollo de la industrialización. El bajo costo de cultivo, la fácil separación de los productos, el medio de fermentación utilizado es barato y no contiene proteínas, lo que favorece la separación y purificación de los productos aguas abajo y reduce los costos de producción. Los genes proteicos exógenos son genéticamente estables y, después de integrarse en los cromosomas de Pichia pastoris, pueden existir de manera estable con la replicación cromosómica y no son fáciles de perder. Además, como sistema de expresión eucariota, Pichia pastoris también tiene una estructura subcelular de un organismo eucariota, capaz de realizar modificaciones posttraduccionales de las proteínas expresadas, como glicosilación, Acilación grasa y Fosforilación de proteínas, para que las proteínas expresadas estén más cerca de las proteínas naturales en estructura y función y tengan una mayor actividad biológica.

II. composición del sistema de expresión de Pichia pastoris

1. bacterias huésped

En la actualidad, las bacterias huéspedes de Pichia pastoris utilizadas para la expresión de proteínas exógenas son: la mayoría de las bacterias huéspedes, como MUT + metanol gs115, X - 33, smd1165, smd1163 y smd1168; El uso lento de metanol de muts km71; Mut - metanol no utiliza el tipo mc100 - 3. Para más detalles, consulte la siguiente tabla, que enumera en detalle las diferentes bacterias huésped de expresión y las características de expresión de Pichia pastoris.

Tabla 1 Pichia pastoris común expresa bacterias huésped y sus características

CEPA	característica
GS115	Tiene un alto nivel de expresión, alta densidad celular y alto rendimiento de proteínas solubles, y actualmente es una bacteria huésped ampliamente utilizada.
KM71	El metanol se utiliza de forma lenta y es adecuado para expresar proteínas difíciles de disolver.
X33	Puede aumentar la cantidad y la actividad de expresión y es adecuado para expresar proteínas recombinantes.
SMD1168H	Mejor eficiencia de expresión y mayor densidad celular, adecuada para la expresión de proteínas macromoleculares
SMD116 (his4 pep4)	Es una cepa carente de proteasa que puede reducir la degradación de las proteínas y resolver el problema de la distribución desigual de los productos de expresión debido a la degradación de las proteínas, pero esta cepa crece relativamente lentamente y puede conducir a una menor producción de proteínas exógenas expresadas.
El Y-11430	Capacidad de expresión eficiente y expresión ajustable

2. transportistas

El vector de expresión de Pichia pastoris es principalmente un vector integrado, y el vector común se puede dividir en un vector de expresión celular y un vector de expresión secretora.

Tabla 2 Pichia pastoris común expresa portadores de alojamiento y sus características

3. proceso de fermentación de Pichia pastoris

1. fase de fermentación de Pichia pastoris

La fermentación de Pichia pastoris se divide generalmente en dos etapas: 1. fase de crecimiento celular: primero en un medio cuya fuente de carbono es glicerina o glucosa, se acumula suficiente densidad celular y biomasa, y cuando la concentración celular alcanza una determinada etapa, cuando la glicerina o la glucosa se agotan, hace que el valor de oxígeno disuelto aumente repentinamente a alrededor del 100%, y luego comienza a fluir una solución de glicerina o glucosa, y se mantiene la ventilación y la velocidad de agitación para mantener el nivel de oxígeno disuelto en torno al 30%, aumentando aún más la biomasa (concentración bacteriana). 2. fase de inducción: cuando la biomasa cumpla con los requisitos, se detendrá la reposición de la fuente de carbono, la fuente de carbono se agotará y, una vez finalizado el período de transición, la fuente de carbono se cambiará al metanol para inducir la fase de fermentación de la proteína objetivo de expresión. Por lo general, la adición intermitente de metanol al 0,3% se induce dos veces antes de comenzar a inducir proteínas de expresión por metanol de flujo, lo que puede aumentar los niveles de expresión de proteínas exógenas y hacer que Pichia acumule altas concentraciones de proteínas objetivo en un período más corto de tiempo.

La fase de expresión inducida es un eslabón clave en el proceso de producción de fermentación de Pichia pastoris, en la que el metanol se utiliza como inductor específico en lugar de la fuente de carbono anterior. Los genes de la alcoxidasa (como aox1) en Pichia pastoris se activan en presencia de metanol, impulsando así la expresión eficiente de genes exógenos. El control de las condiciones en esta etapa tiene un impacto importante en el rendimiento y la calidad de las proteínas exógenas, y es necesario controlar estrictamente parámetros como la cantidad de adición de metanol, la tasa de adición y la temperatura, el pH y el oxígeno disuelto del entorno de fermentación para garantizar que los genes exógenos puedan expresarse de manera continua y eficiente, evitando al mismo tiempo la toxicidad celular del metanol y otros efectos adversos.

2. tipos y fórmulas de medios de fermentación

Hay una variedad de medios de fermentación de Pichia pastoris, y diferentes fórmulas de medios de cultivo son adecuadas para diferentes etapas y propósitos de fermentación.

El medio bsm (sal básica) es uno de los medios básicos comúnmente utilizados en la fermentación de Pichia pastoris. sus fórmulas típicas son: 85% de ácido fosfórico 26,7 ml / l, sulfato de calcio dihidrato 0,93 G / l, sulfato de potasio 18,2 G / l, sulfato de magnesio heptahidratado 14,9 G / l, hidróxido de potasio 4,13 G / l, glicerina 40,0 G / l, ptm1 4,35 ml / L. Este medio de cultivo puede proporcionar nutrientes básicos para el crecimiento de Pichia pastoris, incluyendo sal inorgánica como fuente de nitrógeno, fuente de fósforo, fuente de potasio, fuente de magnesio y glicerina como fuente de carbono, mientras que ptm1 complementa nutrientes como oligoelementos y vitaminas necesarios para el crecimiento de la levadura, ayudando a mantener el crecimiento y metabolismo normales de las células de levadura.

El medio f22 es también un medio común de fermentación por Pichia pastoris, cuya fórmula puede ajustarse en diferentes aplicaciones de investigación y producción, pero generalmente contiene cantidades adecuadas de fuentes de carbono (como glucosa o glicerina), fuentes de nitrógeno (como extractos de levadura, péptidos, etc.), sales inorgánicas (como sulfato de magnesio, cloruro de calcio, fosfato de dihidrógeno de potasio, etc.) y otros aditivos (como biotina, soluciones de oligoelementos, etc.). En comparación con los medios bsm, los medios f22 pueden optimizarse en la composición y proporción de nutrientes para satisfacer necesidades específicas de fermentación, como, en algunos casos, pueden ser más propicios para aumentar la expresión de proteínas exógenas o mejorar la calidad de las proteínas.

Además de los dos medios comunes mencionados anteriormente, hay muchos otros medios de fermentación de Pichia pastoris, cuya fórmula a menudo se optimiza y ajusta de acuerdo con el propósito experimental específico, las características de la CEPA y los requisitos del proceso de fermentación. Por ejemplo, en algunos estudios, para mejorar la utilización de Pichia pastoris de un sustrato específico o aumentar su tolerancia a la presión ambiental, se añaden algunos ingredientes especiales al medio de cultivo, como aminoácidos, ácidos orgánicos, polisacáridos, etc. O optimizar el crecimiento y las vías metabólicas de las células de levadura ajustando la proporción de fuentes de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas en el medio de cultivo, logrando así una mayor eficiencia de fermentación y rendimiento de productos.

3. parámetros del proceso de fermentación

Durante la fermentación de Pichia pastoris, el control preciso de los parámetros del proceso juega un papel vital en el éxito de la fermentación. estos parámetros incluyen ph, temperatura, oxígeno disuelto, etc. están interrelacionados e interactúan entre sí, determinando conjuntamente el Estado de crecimiento de Pichia pastoris, la actividad metabólica y el nivel de expresión de proteínas exógenas.

Ph: es uno de los factores clave que afectan la fermentación de Pichia pastoris. Pichia pastoris requiere diferentes valores de ph en diferentes etapas de crecimiento y procesos metabólicos. En la etapa de crecimiento celular, el rango de pH generalmente adecuado es de 5,0 - 6,0. en esta condición de ph, las células de levadura pueden mantener un buen estado de crecimiento y la actividad de las enzimas puede jugarse mejor, lo que favorece la proliferación celular y la acumulación de metabolitos. El pH durante la fermentación de Pichia pastoris no solo afectará el Estado de crecimiento de la bacteria, sino que también tendrá un impacto importante en la expresión de proteínas exógenas. Los efectos del pH en Pichia pastoris incluyen principalmente los siguientes aspectos: (1) afectar la actividad de las enzimas celulares, lo que a su vez afecta el metabolismo celular, lo que también afecta la expresión de proteínas exógenas; (2) afectar la permeabilidad de la membrana celular y tener un cierto impacto en la absorción celular de nutrientes y la expulsión de metabolitos; (3) el pH puede afectar la desintegración de los componentes y metabolitos de la célula en el medio de cultivo, afectando así la absorción de nutrientes por la célula; (4) el pH también puede tener un impacto en el proceso metabólico de la célula, alterando el contenido de los metabolitos celulares. además, durante la fermentación de alta densidad, para reducir la degradación de las proteínas exógenas por la proteasa, se debe evitar el pH óptimo de la acción de la proteasa y establecer el pH en puntos eléctricos como desviarse de las proteínas exógenas, lo que también aumentará la tasa de cosecha de proteínas exógenas.

Temperatura: también tiene un efecto significativo en el crecimiento y metabolismo de Pichia pastoris. La temperatura de crecimiento de Pichia pastoris es generalmente más adecuada entre 28 y 30 grados celsius. Dentro de este rango de temperatura, las células de levadura crecen más rápido y tienen una fuerte actividad metabólica, lo que puede utilizar eficientemente los nutrientes en el medio de cultivo para crecer y reproducirse. Sin embargo, si la temperatura es demasiado alta, por encima de los 32 ° c, puede causar la muerte celular, ya que las altas temperaturas pueden destruir la estabilidad de biomacromoles como la estructura de la membrana celular, proteínas y ácidos nucleicos, afectando así el funcionamiento fisiológico normal de la célula. Por el contrario, a temperaturas más bajas, aunque el crecimiento celular se ralentiza, algunos estudios han demostrado que una reducción adecuada de la temperatura de cultivo puede mejorar el rendimiento y la calidad de las proteínas diana. Esto se debe a que las bajas temperaturas pueden reducir el estrés del plegado de proteínas dentro de la célula, reducir la aparición de plegado incorrecto, pero también reducir la actividad de la proteasa y reducir el grado de hidrolización de proteínas exógenas, lo que favorece el plegado y acumulación correctos de proteínas exógenas.

Oxígeno disuelto (do): es otro parámetro clave del proceso de fermentación de Pichia pastoris. Pichia pastoris requiere la participación de oxígeno tanto en el crecimiento como en el metabolismo utilizando glicerina y metanol, por lo que mantener niveles adecuados de oxígeno disuelto es esencial para garantizar el buen desarrollo de la fermentación. Durante todo el proceso de fermentación, generalmente es necesario mantener la concentración de oxígeno disuelto en un nivel superior al 20%. En las primeras etapas del crecimiento celular, debido al pequeño número de bacterias, la demanda de oxígeno es relativamente baja, en este momento, las necesidades de oxígeno disuelto de las células se pueden satisfacer mediante ventilación y agitación adecuadas. A medida que las células crecen y la actividad metabólica aumenta, el consumo de oxígeno aumenta gradualmente, en este momento es necesario ajustar aún más la ventilación, la velocidad de agitación o utilizar suplementos de oxígeno puro para aumentar los niveles de oxígeno disuelto para garantizar que las células puedan obtener suficiente oxígeno para metabolizar. Si el oxígeno disuelto es insuficiente, puede causar un crecimiento celular lento, una disminución de la acumulación de metabolitos e incluso la muerte celular, lo que afecta seriamente la eficiencia de la fermentación y la producción de productos.

Tiempo de cultivo: uno de los factores más críticos para obtener el nivel más alto de expresión de proteínas en el sistema de expresión de Pichia pastoris, en el que el tiempo de producción es relativamente largo (aproximadamente 100h). El tiempo de cultivo está relacionado con el número de células de levadura y el grado de degradación de la proteína objetivo. hay estudios que muestran que la densidad máxima de crecimiento de las células de Pichia pastoris es de 96 horas de cultivo, mientras que la expresión máxima de la proteína se produce en 48 horas [11], lo que sugiere que es probable que un tiempo de cultivo más largo conduzca a la digestión hidrolítica de la proteína expresada, y hay otros estudios que sugieren que el mejor tiempo de expresión de la proteína ocurre entre 72 y 96 horas de cultivo [2].

El proceso de fermentación de Pichia pastoris es un proceso complejo y fino que requiere un control y optimización precisos de la etapa de fermentación, la fórmula del medio de cultivo y los parámetros del proceso. las condiciones de fermentación se pueden optimizar sistemáticamente a través del método de diseño experimental (due), como el ph, la temperatura, el oxígeno disuelto y la composición del medio de cultivo para aprovechar al máximo las ventajas de Pichia pastoris y lograr una expresión y producción eficientes de proteínas exógenas. A través de una comprensión profunda de las características y necesidades de fermentación de Pichia pastoris, combinada con tecnologías y equipos avanzados de fermentación, se espera optimizar constantemente el proceso de fermentación, lo que mejorará aún más la eficiencia y la calidad del producto de la fermentación de Pichia pastoris.

4. la "cooperación tácita" entre Pichia pastoris y el fermentador

En el proceso de fermentación de Pichia pastoris, el fermentador, como equipo central, proporciona condiciones ambientales clave para el crecimiento y metabolismo de Pichia pastoris, asegurando que puede expresar proteínas exógenas de manera eficiente.

El fermentador proporciona una temperatura de crecimiento adecuada para Pichia pastoris a través de un sistema preciso de control de temperatura. Como se mencionó anteriormente, el sistema de control de temperatura del fermentador puede mantenerse con precisión dentro de estos rangos de temperatura establecidos, evitando los efectos adversos de las temperaturas excesivas o bajas en el crecimiento de las células de levadura y la expresión de proteínas durante la fase de crecimiento de Pichia pastoris a 28 - 30 ° C y los requisitos específicos para las temperaturas durante la fase de expresión inducida. En la producción de fermentación a gran escala, este control preciso de la temperatura es particularmente importante, lo que garantiza que cada lote de Pichia puede crecer en un ambiente de temperatura estable y adecuado, mejorando así la estabilidad y repetibilidad de la producción.

Para la regulación del ph, el fermentador está equipado con dispositivos avanzados de detección y regulación del Ph. En las diferentes etapas de la fermentación de Pichia pastoris, de acuerdo con sus cambios en la demanda de ph, el fermentador puede agregar automáticamente soluciones alcalinas y alcalinas para mantener el pH exactamente dentro del rango necesario. Manteniendo el pH 5,0 - 6,0 durante la fase de crecimiento celular, la fase de expresión inducida se ajusta a 3,0 - 5,0. este control preciso del pH ayuda a mantener la actividad de las enzimas en las células de levadura, promoviendo el crecimiento y metabolismo normales de las células, reduciendo al mismo tiempo la degradación de las proteínas exógenas y mejorando el rendimiento y la calidad de las proteínas.

El control del nivel de oxígeno disuelto también es una de las funciones clave del fermentador. Pichia pastoris tiene una alta demanda de oxígeno disuelto durante el proceso de fermentación, y el fermentador garantiza que la concentración de oxígeno disuelto siempre se mantenga en un nivel superior al 20% a través de un sistema de ventilación razonable y un dispositivo de agitación. El sistema de ventilación es capaz de introducir aire o oxígeno uniformemente en el caldo de fermentación, mientras que el dispositivo de agitación hace que el oxígeno se disperse completamente en el caldo de fermentación a través de la agitación continua, mejorando la eficiencia de transmisión del oxígeno, satisfaciendo las necesidades de oxígeno de Pichia pastoris en diferentes etapas de crecimiento, garantizando el desarrollo normal de su actividad metabólica y promoviendo así la expresión eficiente de proteínas exógenas.

La sinergia entre el sistema de agitación y ventilación también garantiza una distribución uniforme de los nutrientes en el caldo de fermentación, evitando la deficiencia o exceso de nutrientes locales, para que cada célula de Pichia pueda crecer en un buen ambiente nutricional. Al mismo tiempo, el rendimiento de sellado del fermentador también es muy importante, puede prevenir la contaminación de bacterias diversas externas, garantizar la pureza y estabilidad del proceso de fermentación de Pichia pastoris y evitar problemas como el fracaso de la fermentación o la disminución de la calidad del producto debido a la infección por bacterias.

Los productos de fermentador de jinwei Biotechnology están diseñados y fabricados sobre la base de estas necesidades clave, con un control avanzado de temperatura, regulación de ph, control de oxígeno disuelto y un sistema de mezcla y ventilación eficiente, que puede proporcionar condiciones ambientales optimizadas para la fermentación de Pichia pastoris, ayudar a los usuarios a lograr una producción de fermentación de Pichia pastoris eficiente y estable, ya sea en la etapa de prueba de laboratorio o en la producción industrial a gran escala, puede desempeñar un papel en el rendimiento, satisfacer las diversas necesidades de diferentes usuarios para la fermentación de Pichia pastoris y ayudar al vigoroso desarrollo de la industria biotecnológica. Seguiremos prestando atención a la dinámica de investigación y las necesidades de aplicación de Pichia pastoris, optimizaremos e innovaremos constantemente la tecnología de diseño y fabricación de fermentadores, mejoraremos el rendimiento y la estabilidad de los fermentadores, proporcionaremos un apoyo de equipo más avanzado y eficiente para la producción de fermentación de Pichia pastoris y promoveremos conjuntamente la industria biotecnológica hacia un futuro más brillante.

Introducción del fermentador de los trabajadores de jinwei
Jimway-be ® Serie LAB - reactor de Mesa

Jimway-be ® Serie PM - reactor biológico múltiple

Ocasión aplicable: cultivo y fermentación y expresión de procarióticos / eucariotas

Volumen de la placa de petri: 250ml / 500ml / 1l / 3l / 5L / 10l

Número de unidades: 2 - 16 unidades

Método de cultivo: suspensión & pegado a la pared

Tipo de hoja: tres hojas oblicuas, seis hojas oblicuas, seis hojas planas, medio tubo, remo de elevación y otras combinaciones

Modo de transmisión: accionamiento de Acoplamiento magnético / agitación mecánica

Estrategia de control: EIP & estrategia de control escalonada (reabastecimiento, velocidad de agitación, temperatura, ventilación, etc.)

Control de reposición: control de reposición preciso (error ± 1g)

Características funcionales:

La interfaz es simple: unos minutos para dominar la operación y hacer más con menos

Desatendido: se puede acceder y operar de forma remota para lograr desatendido

Función de fórmula: la fórmula se emite con un solo clic para reducir los errores de operación del personal y mejorar la calidad

Análisis de datos: se realiza la comparación de datos de varios lotes, y también se puede conectar Doo & PAT para realizar análisis multivariables profundos y optimizar los datos del proceso.

Intercambio de datos: publicación web basada en vpn, que realiza el monitoreo y la visualización de la curva histórica del terminal móvil (android, ios, windows) garantizando la seguridad de los datos y la seguridad del dispositivo