La columna de intercambio de iones positivos mixtos combina el modo de doble retención del intercambio de iones positivos y la cromatografía de fase inversa. su método de operación debe tener en cuenta las características de los dos mecanismos. los pasos específicos y los puntos clave son los siguientes:
I. preparación previa a la operación
Selección de columnas
Las columnas híbridas adecuadas se seleccionan de acuerdo con las propiedades del compuesto objetivo (como el valor PKA y la polaridad). Por ejemplo, las columnas de grupos de ácido sulfónico fuertemente ácido son adecuadas para compuestos alcalinos de pka2 - 10 (como aminas, sulfonamidas).
Confirme la estabilidad de la matriz de columnas (como el polímero de estireno - divinilbenceno) y los grupos funcionales (como el Grupo sulfónico), asegurando que no se descompongan en el rango pH 0 - 14 y en el disolvente orgánico.
Inspección del equipo
Comprobar si el caudal y el rango de presión del sistema de cromatografía (por ejemplo, clar) coinciden con los requisitos de la columna (por ejemplo, la presión máxima de la columna de acero inoxidable es de 4.500 PSI y la columna de vidrio es de 3.000 psi).
Instalar columnas de protección para evitar que las columnas de análisis estén contaminadas o bloqueadas.
Preparación del reactivo
Preparar líquidos de elución (como solución de metanol ácido, amortiguador de ácido cítrico) y desgasificar y filtrar (película filtrante de 0,2 - 0,5 micras) para evitar la interferencia de burbujas y partículas.
Preparar disolventes activados (como metanol, agua) y líquidos de elución (como mezclas que contengan disolventes orgánicos y sales amortiguadoras).
II. pasos operativos
Activación de columnas
Objetivo: eliminar las impurezas, hacer que la fase fija se hinche completamente y garantizar la eficiencia de la columna.
Método:
Las columnas se activan sucesivamente con metanol (3 - 5 veces el volumen de la cama de la columna, con una velocidad de flujo de 1 - 5 ml / min) y agua (el mismo volumen y velocidad de flujo).
Si la columna no se utiliza durante mucho tiempo, primero debe enjuagarse con una gran cantidad de agua, luego enjuagarse con metanol y finalmente conservarse en una solución acuosa que contenga 50% de metanol.
Muestra en la muestra
Objetivo: combinar el objeto objetivo con la fijación, y las impurezas salen con la fase móvil.
Método:
Pasar lentamente la solución de muestra a través de la columna a un caudal de 0,5 - 2 ml / MIN garantiza un contacto uniforme con la fase de fijación.
Si la concentración de la muestra es demasiado alta, es necesario diluirla para evitar exceder la capacidad de carga de la columna.
Lavado y eliminación de misceláneas
Objetivo: eliminar las impurezas que son diferentes de las propiedades del objeto objetivo pero que se absorben en la columna.
Método:
Elija un líquido de elución que contenga disolvente orgánico y sal tampón (como una solución de agua de metanol al 5%), con una dosis de 3 - 5 veces el volumen de la cama de columna y un caudal de 1 - 3 ml / min.
Para evitar que el objeto objetivo se eluda, es necesario optimizar el tipo y la proporción de líquido de elución.
Elución del objeto objetivo
Objetivo: destruir la interacción entre el objeto objetivo y la fase fija y recoger el eluido.
Método:
Se seleccionó una mezcla de ácido / álcali de alta concentración y disolvente orgánico (como una solución de metanol ácido) como eluyente, con una dosis de 2 - 4 veces el volumen de la cama de columna y una velocidad de flujo de 1 - 3 ml / min.
Recoger el líquido de elución para evitar la pérdida del objeto objetivo causada por la elución excesiva.
Regeneración y conservación de columnas
Objetivo: restaurar el estado inicial de la columna y prolongar su vida útil.
Método:
Primero enjuagar la columna con una gran cantidad de agua, luego enjuagarla con metanol, y finalmente conservarla en una solución acuosa que contiene 50% de metanol, sellarla y colocarla a la temperatura adecuada.
Si la columna está contaminada, se puede limpiar con soluciones especiales como 1mnh ₄ no ₃ o alcohol isopropílico.
III. precauciones clave
Control de velocidad
Evitar la disminución de la eficiencia de la columna o la pérdida de la fase fija debido a la velocidad de flujo demasiado rápida, y la velocidad de flujo demasiado lenta prolonga el tiempo de análisis.
Es necesario cambiar gradualmente al ajustar la velocidad de flujo para evitar perturbaciones en la cama de llenado.
Límites de pH y temperatura
Evite dañar las columnas de la matriz de silicona con un pH extremo, como un disolvente alcalino con un pH superior a 6,5 o un disolvente ácido con un pH inferior a 2,5.
Se recomienda que las columnas se utilicen a temperatura ambiente por debajo de 40 ° c, y las altas temperaturas pueden reducir la estabilidad.
Selección de eluyentes
Evite usar amortiguadores que contengan productos de descomposición como el ácido nucleico para no cambiar las propiedades de las fases fijas.
El eluyente debe prepararse fresco para evitar que la contaminación microbiana o los cambios en la intensidad de los iones afecten el efecto de separación.
Pretratamiento de muestras
Filtrar las muestras para eliminar las impurezas de las partículas y evitar bloquear las columnas.
Si la polaridad de la muestra es muy diferente de la fase móvil, se necesita un tratamiento de derivación o dilución.
IV. ejemplos de escenarios de aplicación
Pruebas de Seguridad alimentaria: al detectar la melamina (compuesto alcalino) en la leche, se utiliza una columna de fase inversa de intercambio catiónico débil mixto para lograr una separación eficiente a través del modo dual de intercambio catiónico y retención de fase inversa.
Análisis de fármacos: al analizar los fármacos alcalinos y sus metabolitos en la sangre, se utiliza el mecanismo de doble retención de la columna de fase inversa de intercambio catiónico fuerte mixto para mejorar la eficiencia y sensibilidad de la separación.
Monitoreo ambiental: al detectar contaminantes alcalinos en el agua (como compuestos aminérgicos), se logra una elución rápida y un análisis cuantitativo de los objetivos optimizando las condiciones de elución.