Las pruebas de proteínas realizadas por los analizadores cuantitativos de ácidos nucleicos ultratraza (por ejemplo, los determinadores de proteínas de ácidos nucleicos ultratraza) se basan principalmente en la espectrometría ultravioleta - visible, que estima su concentración midiendo la absorción de proteínas en una longitud de onda específica (por ejemplo, 280 nm). Los siguientes son los métodos específicos y pasos clave para probar sus proteínas:
I. principios de las pruebas
Los residuos de triptófano (trp), tirosina (tyr) y el enlace disulfido Cys - Cys en la molécula proteica se absorbieron significativamente a 280 nm de fuerza de onda. El instrumento calcula directamente la concentración de proteínas (mg / ml) midiendo la Absorbancia de la solución proteica a 280 nm (a280), combinada con la Ley Lambert - beer. Este método no requiere construir una curva estándar, pero debe asegurarse de que la muestra no contenga otras impurezas con una fuerte absorción a 280 nm (como ácidos nucleicos y fenoles).
II. pasos operativos
Preparación del instrumento
Conecte la fuente de alimentación, active el instrumento y precaliente durante 5 - 10 minutos hasta el Estado estable.
Seleccione el modo de detección "proteína a280" y establezca el recorrido óptico (generalmente 10 mm, pero el instrumento puede ajustarse automáticamente).
Calibración cero con agua destilada de alta pureza o amortiguador en blanco para eliminar la interferencia de fondo.
Tratamiento de muestras
Tamaño de la muestra: se recomienda utilizar una muestra de 2 μl (algunos instrumentos admiten microdetección de 0,5 - 2 μl) para garantizar la formación de una columna líquida estable.
Evite las burbujas: toque ligeramente el Fondo del agujero de detección al puntuar la muestra, libere el líquido lentamente y evite que las burbujas afecten la medición de la absorción.
Tensión superficial: si la tensión superficial de la muestra es baja (por ejemplo, contiene detergentes), se puede aumentar la cantidad de muestra a 4 μl para garantizar la estabilidad de la columna líquida.
Control en blanco
Tome 2 μl de solución en blanco (como amortiguador) y agregue a la base inferior, baje la base superior y haga clic en el botón "en blanco" para registrar la absorción de fondo.
Limpie la base para asegurarse de que no haya líquido residual.
Detección de muestras
Tome la muestra a medir de 2 μl y agregue a la base inferior, baje la base superior y haga clic en el botón "muestra".
El instrumento mide automáticamente la absorción y calcula la concentración, y los resultados generalmente se muestran en mg / ML.
Muestras de alta concentración: si el valor de absorción de luz supera el rango del instrumento (por ejemplo, la intensidad de la luz es inferior a 200), es necesario diluir la muestra y volver a detectarla.
Registro y limpieza de datos
Guarde los resultados de la prueba y exporte a csv o formato pdf.
Limpie la base con un paño sin polvo para evitar la contaminación cruzada.
III. precauciones clave
Calibración de referencia
La longitud de onda de calibración de referencia predeterminada es de 340 nm, que el usuario puede ajustar según sea necesario.
La calibración debe completarse antes de la detección de la muestra, de lo contrario los valores espectrales se desviarán, lo que dará lugar a un error en el cálculo de la concentración.
Pureza de la muestra
Evite que la muestra contenga ácidos nucleicos, fenoles o altas concentraciones de iones de sal, que pueden producir absorción de interferencia a 280 nm.
Para detectar muestras que contengan impurezas, se puede combinar el método colorimétrico (como bca, método bradford) o deducir el Fondo utilizando una longitud de onda doble (280 NM / 340 nm).
Mantenimiento de instrumentos
Fuente de luz: evite la exposición prolongada y apague la fuente de luz cuando no esté en uso para prolongar su vida útil.
Monocromador: reemplazar regularmente los secadores (como el silicona) para evitar que los elementos de dispersión se vean afectados por la humedad y el moho.
Detector: evitar que la luz fuerte brille directamente o se vea afectada por la humedad y el polvo, y mantener limpio.
Ambiente: el instrumento debe colocarse en una mesa de trabajo seca y estable, lejos de la salida de aire acondicionado o la luz solar directa, y la temperatura debe controlarse en 25 ℃ ± 2 ℃.
Tratamiento de muestras especiales
Muestra condensada: carga lenta con una pendiente de 45 grados para evitar derrames o interferencia del anillo de newton.
Sustancias polisacáridas: después de la prueba, es necesario lavar el camino líquido con reactivos de etanol para evitar residuos.
Muestra de grasa: si se produce un fenómeno de flotación, se debe separar por centrifugación a baja temperatura antes de detectarlo.
IV. escenarios de aplicación y ventajas
Cuantificación rápida: sin preprocesamiento complejo, la detección se completa en 2 - 5 minutos, lo que es adecuado para la detección de alto rendimiento.
Microdetección: solo se necesitan muestras de 0,5 - 2 μl para ahorrar muestras preciosas (como muestras clínicas, proteínas raras).
Análisis multiparamétrico: algunos instrumentos admiten la detección simultánea de a260 (ácido nucleico), A280 (proteína) y od600 (concentración bacteriana) para lograr la cuantificación de múltiples componentes.
Portabilidad: diseño compacto para pruebas in situ o laboratorios móviles.