[Tratamiento de la aparición de bandas misceláneas en PCR[en inglés]

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La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y la gelografía son técnicas comunes en la investigación de biología molecular y generalmente se combinan para identificar y analizar productos amplificados por pcr. Sin embargo, cuando se realiza la gelografía pcr, a menudo se encuentran bandas misceláneas en el mapa de la gelografía, que pueden interferir con los resultados experimentales e incluso provocar el fracaso del experimento.

Este artículo explorará las causas de las bandas heterogéneas durante la gel PCR y proporcionará algunas soluciones posibles.

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Optimización de las condiciones pcr:Ajustar las condiciones de reacción pcr, la temperatura de recocido demasiado baja dará lugar a una unión no específica entre el primer y la plantilla, lo que desencadenará una amplificación no específica; Si la temperatura de recocido es demasiado alta, puede inhibir la Unión normal de los primeros con la plantilla y afectar la eficiencia de amplificación. La temperatura óptima de recocido se puede determinar gradualmente a través de experimentos de PCR gradiente. en general, la temperatura del paso de recocido de la reacción PCR suele oscilar entre 50 ° C y 68 ° c, dependiendo de la secuencia de base del primer y las características del ADN objetivo. Algunos primeros requieren una temperatura de recocido más alta para garantizar la Unión específica de una región específica, pero en general, la temperatura máxima de recocido no superará los 68 ° c.

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El diseño del primer no es razonable:Si la longitud del primer es demasiado corta, la secuencia se repite o contiene una región de alto gc, puede conducir a una unión no específica del primer con la plantilla, lo que a su vez produce una banda miscelánea. Es necesario rediseñar los Primers para garantizar que la longitud de los Primers sea adecuada, la secuencia no se repita, el contenido de GC sea moderado y evitar la aparición de áreas de GC altas dentro de los Primers o en las áreas de Unión de los Primers con las plantillas.

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La cantidad de primer no es adecuada:La cantidad excesiva de Primers o la baja especificidad pueden conducir a una amplificación no específica, lo que resulta en bandas heterogéneas. Se recomienda cambiar los primeros o reducir el uso de los primeros.

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La plantilla es impura:El ADN de plantilla contiene impurezas, como proteínas, ARN u otros fragmentos de ADN no objetivo, que pueden servir como plantillas para la amplificación pcr, lo que conduce a la aparición de bandas adicionales.

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Degradación de la plantilla:El ADN de plantilla se degrada durante el proceso de extracción o almacenamiento, y los pequeños fragmentos de ADN producidos pueden convertirse en plantillas de amplificación no específica.

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Purificación del ADN de la plantilla:El ADN de plantilla en el experimento PCR puede provenir de varias fuentes, incluyendo ADN genómico (gdna), ADN complementario (adnc) y ADN plasmídico. Sin embargo, el ADN de diferentes fuentes puede variar en composición y complejidad, lo que puede afectar el inicio óptimo de la amplificación pcr. Por ejemplo, en una reacción PCR de 50 μl, el ADN plasmídico solo necesita 0,1 - 1 ng, mientras que el gdna necesita 5 - 50 ng. además, el tipo de polimerasa de ADN utilizada también puede tener un impacto en la cantidad óptima de inicio de plantilla. La polimerasa de ADN modificada tiene una mayor afinidad por la plantilla y una mayor sensibilidad, por lo que se necesita una cantidad relativamente pequeña de iniciación de adn. Optimizar la cantidad de inicio del ADN es crucial, ya que un inicio demasiado alto puede conducir a un aumento del riesgo de amplificación no específica, mientras que un inicio demasiado bajo puede reducir el rendimiento de la pcr. A veces, los protocolos experimentales de PCR utilizan el número de copias para indicar el inicio del adn, especialmente para el ADN G. El cálculo del número de copias implica la constante de Avogadro y la masa mole, y la fórmula específica es: número de copias = l × número Mole = l × (masa total / masa mole).

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La concentración de mg⁺ es demasiado alta:Mg⁺ es un componente importante de la respuesta pcr, pero su concentración excesiva reduce la especificidad de la amplificación PCR y aumenta el riesgo de amplificación no específica. Es necesario determinar experimentalmente la concentración óptima de mg m2.

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La cantidad o la calidad de la enzima no es buena:La dosis excesiva de la enzima o la mala calidad de la enzima pueden afectar la respuesta pcr. Se recomienda reducir la cantidad de enzima o reemplazar la de otra Fuente.

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Use la PCR de arranque en caliente:El arranque en caliente de la PCR puede reducir la amplificación no específica que la reacción puede causar a bajas temperaturas.

La PCR de arranque en caliente es una técnica utilizada para reducir la amplificación no específica. En la PCR convencional, cuando la temperatura de reacción aumenta a la temperatura de amplificación, el primer puede haberse unido al ADN de la plantilla. Esto puede conducir a una amplificación no específica al inicio de la pcr, produciendo un resultado híbrido o falso positivo. La PCR de arranque en caliente resuelve este problema agregando una polimerasa de ADN termoestable a la reacción pcr.

La clave para iniciar la PCR en caliente es usar una polimerasa que requiere activación a altas temperaturas. Tales enzimas se activan a temperaturas más altas, por lo que comienzan a expandir la secuencia de ADN objetivo al inicio de la reacción sin desencadenar una respuesta no específica a bajas temperaturas.

Algunas de las polimerasas de arranque en caliente comunes incluyen versiones mejoradas de las polimerasas Taq estables en caliente, como las polimerasas de ADN Taq con dominios de activación en caliente, y las polimerasas de alta fidelidad como pfu o phusion.

Por lo tanto, las enzimas actuales básicamente cumplen con las condiciones.

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Comprobar el entorno del laboratorio:Evitar la contaminación del ADN y la contaminación de los instrumentos experimentales, utilizar técnicas estériles y reactivos tratados para mantener el laboratorio limpio.

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Optimización del gradiente pcr:La reacción PCR se realiza utilizando un gradiente de temperatura para encontrar la temperatura de amplificación específica.

Instrumento inteligente de PCR de gradiente bidimensional de baiheng TechnologyLa variabilidad del gradiente de temperatura de la desnaturalización y el recocido se puede optimizar simultáneamente en la misma reacción, y la variabilidad del gradiente de temperatura de la desnaturalización transversal de 8 filas se puede establecer longitudinalmente en 12 filas, optimizando así la temperatura óptima de recocido, mejorando así la especificidad y eficiencia de la reacción pcr.

Esta técnica es muy útil para optimizar los primers, plantillas y condiciones PCR para garantizar la obtención de productos PCR de alta calidad y específicos.

Estos métodos se pueden utilizar solos o combinados para ayudar a reducir o eliminar el problema de las bandas misceláneas pcr.