I. antes de su uso: hacer un buen trabajo de pretratamiento y proteger la columna cromatográfica desde la fuente

Activación y equilibrio de la columna: la columna nueva o la columna cromatográfica ociosa durante más de una semana deben equilibrarse con fase móvil durante 30 - 60 minutos (caudal de 1,0 ml / min) antes de su uso para garantizar una infiltración adecuada de la fase fija; Las columnas de fase inversa (como c18) pueden lavar primero el volumen de 20 columnas con metanol / agua (90: 10) y luego cambiar a la fase móvil de la muestra para evitar la disminución del rendimiento causada por el secado de la fase fija. Si el disolvente de conservación en la columna no es compatible con la fase móvil (por ejemplo, la columna de fase positiva se conserva con n - hexano y la fase móvil es metanol), es necesario enjuagarlo con un gradiente de disolvente de transición para evitar que el disolvente se disuelva entre sí y produzca burbujas o colapso de la fase fija.

Purificación de la muestra y la fase móvil: la muestra debe ser filtrada por una membrana filtrante de 0,22 micras para eliminar partículas y suspensiones y evitar bloquear la placa de tamiz de la columna; Las muestras que contienen impurezas, proteínas y grasas de alto punto de ebullición deben purificarse con antelación mediante extracción en fase sólida (spe) y otros métodos para evitar que las impurezas se adsorban en la fase fija. La fase móvil necesita desgasificación ultrasónica durante 15 - 20 minutos para eliminar las burbujas (las burbujas pueden causar fluctuaciones de presión de la columna y formas pico anormales); Al usar la fase móvil de sal tampón, es necesario prepararla con agua de alta pureza (como agua ultrapura), que se utiliza ahora después de la filtración para evitar que la cristalización de sal bloquee la columna cromatográfica.

Inspección del Estado del instrumento: antes de instalar la columna cromatográfica, limpie el revestimiento de la entrada de la muestra, reemplace la almohadilla de envejecimiento y evite que los escombros de la almohadilla y los residuos de la muestra entren en la columna; Comprobar si hay fugas y obstrucciones en la tubería para garantizar que la presión frente a la columna sea estable; Asegúrese de que la Junta de la columna está bien sellada y elija una almohadilla de grafito adecuada para evitar fugas de gas portador o daños en la columna causados por presión desigual.

2. en uso: estandarizar la Operación para evitar daños en la columna

Control de temperatura y presión: cumplir estrictamente con la temperatura máxima de uso de la columna cromatográfica (la columna de fase inversa suele ser ≤ 60 ° C y la columna de fase positiva ≤ 80 ° c) para evitar la pérdida de fase fija acelerada a alta temperatura; La presión de la columna debe controlarse dentro del rango recomendado de fábrica (generalmente ≤ 40 mpa), si la presión aumenta repentinamente en más del 30%, es necesario detener inmediatamente la investigación (como filtrar la fase móvil y limpiar la entrada de la muestra) para evitar que la presión excesiva provoque la compactación de la fase fija y el colapso del lecho de la columna. Se recomienda que la tasa de calentamiento sea ≤ 10 ° C / MIN para evitar que el aumento repentino de la temperatura destruya la estructura de la columna.

Especificaciones para el uso de la fase móvil: evite el uso de disolventes altamente corrosivos (como ácido clorhídrico concentrado, hidróxido de sodio), el rango de pH de la fase móvil de la columna de fase inversa debe controlarse en 2 - 8 (excepto la columna alcalina especialmente resistente al ácido), fuera del alcance puede conducir a la disolución de la matriz de silicona y La degradación de la fase fija. Al eluir el gradiente, el cambio proporcional de la fase orgánica no debe ser demasiado rápido (por ejemplo, el cambio por minuto es ≤ 10%) para evitar una fuerte contracción o expansión de la fase fija; Después de usar la fase móvil que contiene sal tampón, es necesario enjuagarla con una alta proporción de fase de agua a tiempo para evitar la cristalización de sal.

Requisitos de la operación de inyección de muestra: la cantidad de inyección de muestra debe coincidir con la capacidad de la columna (la cantidad de inyección de la columna C18 convencional es ≤ 20 μl) para evitar la contaminación de la cola pico y la fase fija causada por la sobrecarga; La temperatura de la entrada de la muestra se establece razonablemente, 10 - 20 ° C por encima del punto de ebullición máximo de la muestra, pero no más de la temperatura máxima de uso de la columna, evitando que la descomposición de la muestra produzca impurezas que contaminan la columna. Evitar la inyección continua de muestras de alta concentración y alta contaminación, se recomienda lavar el volumen de 10 - 15 columnas con fase móvil en blanco después de cada 10 - 20 agujas de inyección.

3. después de su uso: limpiar a tiempo para prolongar la vida útil de la columna

Proceso de limpieza convencional: después del experimento, lavar la columna con gradiente de fase móvil para eliminar las muestras residuales y las impurezas. Columna de fase inversa: enjuagar primero el volumen de 20 columnas con metanol / agua (50: 50), y luego enjuagar el volumen de 30 columnas con metanol puro o nitrilo para eliminar las impurezas fuertemente adsorbentes; Columna de fase positiva: enjuagar el volumen de 20 columnas con n - hexano / alcohol propano (90: 10) y conservarlo con n - hexano puro. Si la muestra contiene proteínas, grasas y otras impurezas difíciles de eluir, se puede agregar un 5 - 10% de THF al proceso de limpieza para mejorar el efecto de elución, pero se debe prestar atención a la compatibilidad de THF con algunas fases fijas.

Tratamiento especial de la contaminación: si la presión de la columna aumenta y la cola en forma de pico es grave, puede ser contaminación en la columna, se puede realizar una limpieza profunda. Columna de fase inversa: enjuagar con gradiente secuencial de metanol → metanol / THF (80: 20) → metanol → nitrilo, 20 volúmenes de columna por paso; Columna de fase positiva: enjuagar con n - butano → n - butano / acetato de dietilo (50: 50) → n - butano. Está prohibido lavar la columna de fase positiva con disolventes polares fuertes (como cetona y diclorometano) para evitar la pérdida de fase fija.

Método de conservación: conservación a corto plazo (dentro de un mes): la columna de fase inversa se conserva sellada con metanol puro o nitrilo, y la columna de fase positiva se conserva con n - hexano para garantizar que no haya burbujas en la columna; Conservación a largo plazo (más de un mes): la columna de fase inversa se conserva con metanol / agua (90: 10) y la columna de fase positiva se conserva con n - hexano / alcohol isopropílico (95: 5) para evitar que la fase fija se seque y envejezca. Al conservar, es necesario sellar ambos extremos de la columna cromatográfica con tapones y colocarla en un lugar fresco y seco (temperatura de 5 - 30 grados celsius) para evitar la luz solar directa.

A través del mantenimiento de las especificaciones anteriores, la vida útil de la columna de Cromatografía líquida de alto rendimiento se puede extender a 1000 - 2000 análisis, al tiempo que se garantiza la precisión y repetibilidad de los datos de detección y se reducen los costos de uso. Los métodos de mantenimiento de diferentes tipos de columnas cromatográficas (como columnas de intercambio de iones y columnas quirales) deben ajustarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante, centrándose en la compatibilidad de la fase móvil y las características de la fase fija.