El uso y mantenimiento correctos de la columna cromatográfica es muy importante, y un poco de descuido reducirá la eficiencia de la columna, acortará la vida útil e incluso dañará. Durante la manipulación de la columna, es necesario prestar atención a los siguientes temas para mantener la columna.
① evitar cambios drásticos en la presión y la temperatura y cualquier vibración mecánica. Los cambios repentinos en la temperatura o la caída de la columna cromatográfica desde una altura pueden afectar el Estado de llenado de la columna; El aumento repentino o la disminución de la presión de la columna también impulsará el relleno de la columna, por lo que debe llevarse a cabo lentamente al ajustar el flujo, y la rotación de la válvula no debe ser demasiado lenta al inyectar la válvula (como se mencionó anteriormente).
② la composición del disolvente debe cambiarse gradualmente, especialmente en la cromatografía de fase inversa, y no debe cambiarse directamente del disolvente orgánico al agua en su totalidad, y viceversa.
③ en términos generales, la columna no se puede retroceder, y solo cuando el productor indica que la columna se puede retroceder, se pueden retroceder las impurezas que permanecen en la cabeza de la columna. De lo contrario, el retroceso reducirá rápidamente el efecto de la columna.
④ elija usar la fase móvil adecuada (especialmente el ph) para evitar que la fase fija se destruya. A veces se puede conectar una precolumna frente al muestreador. cuando la columna de análisis es silicona unida, la precolumna es silicona, lo que puede hacer que la fase activa esté 'saturada' por silicona antes de entrar en la columna de análisis y evitar la disolución de la matriz de silicona en la columna de análisis.
⑤ para evitar la inyección directa de muestras con sustratos complejos, especialmente muestras biológicas, en la columna, es necesario pretratamiento de la muestra o conectar una columna protectora entre el muestreador y la columna cromatográfica. Las columnas de protección son generalmente columnas cortas llenas de fases fijas similares. Las columnas de protección se pueden y deben cambiarse con frecuencia.
Lavar a menudo la columna con un fuerte disolvente para eliminar las impurezas conservadas en la columna. Al limpiar, el reemplazo de la fase activa en el sistema de carreteras convectivas debe transitar gradualmente con un disolvente miscible, y el volumen de cada fase activa debe ser aproximadamente 20 veces mayor que el volumen de la columna, es decir, el análisis convencional requiere de 50 a 75 ML.
A continuación se enumeran los disolventes de limpieza y el orden de algunas columnas cromatográficas como referencia: las columnas de silicona se enjuagan sucesivamente con n - hexadecano (o heptano), Diclorometano y metanol, y luego se enjuagan en orden inverso, todos los disolventes deben deshidratarse estrictamente. El metanol se puede lavar a las impurezas polares fuertes residuales, y el hexadecano reactiva la superficie del silicona. La columna de fase inversa se enjuaga a su vez con agua, metanol, nitrilo, cloro - metano (o cloroformo), y luego se enjuaga a su vez en orden inverso. Si la fase activa utilizada para el siguiente análisis no contiene amortiguador, se puede omitir el paso de enjuagar con agua después de zui. El monoclorometano puede lavar las impurezas no polares residuales, y la inyección repetida de 100 a 200 μl de tetrahidrofurano durante el lavado con metanol (nitrilo) varias veces ayuda a eliminar las impurezas hidrofóbicas fuertes. La solución mixta de tetrahidrofurano con nitrilo o metanol puede eliminar los lípidos. A veces se inyecta Dmso varias veces. Además, la elución gradiente con nitrilo, cetona y ácido trifluoroacético (0,1%) puede eliminar la contaminación por proteínas.
La columna de intercambio catiónico se puede lavar con un tampón ácido diluido, y la columna de intercambio aniónico se puede lavar con un tampón alcalino diluido, eliminando la sal con un fuerte rendimiento de intercambio, y luego enjuagando con agua, metanol, Diclorometano (excepto la materia orgánica adsorbida en la superficie de la fase fija), metanol y agua a su vez.
Al conservar la columna cromatográfica, la columna debe estar cubierta con nitrilo o metanol, y la Unión de la columna debe apretarse para evitar que el disolvente se volatilice y se seque. Está prohibido dejar la solución tampón en la columna durante la noche o más.
Durante el uso de la columna cromatográfica, si la presión aumenta, una posibilidad es que el filtro sinterizado esté bloqueado, en este momento, el filtro debe reemplazarse o extraerse para su limpieza; Otra posibilidad es que las moléculas grandes entren en la columna para contaminar la cabeza de la columna; Si la eficiencia de la columna disminuye o el pico del espectro se deforma, el estigma puede colapsar y el volumen muerto aumenta.
Cuando ocurran los dos últimos casos, desenrosque cuidadosamente la Junta de la columna, retire el relleno de la columna a una altura de 1 a 2 mm con acero pequeño limpio (preste atención a limpiar el relleno contaminado) y luego nivele el relleno de la columna. Luego llene la columna con una fase fija humectada con un disolvente adecuado (la misma que en la columna), presione plana y luego apriete el conector de la columna. Después de este tratamiento, la eficiencia de la columna se ha mejorado, pero es difícil volver al nivel de la nueva columna.