La columna cromatográfica es el componente central del sistema de análisis cromatográfico, y su método de embalaje afecta directamente la eficiencia de la separación, la simetría de la forma del pico y la vida útil de la columna. El proceso de relleno razonable debe tener en cuenta las características del relleno, la uniformidad del relleno, la estabilidad del lecho de columna y las necesidades de uso posterior. A continuación se detallan el proceso de llenado y los puntos técnicos de la columna cromatográfica desde los tres aspectos del tratamiento previo del relleno, el método de llenado y el tratamiento posterior al llenado.

I. tratamiento previo al relleno

1. selección y tratamiento de rellenos

- tamaño y distribución de las partículas: la selección de rellenos con un tamaño adecuado de las partículas (generalmente 3 - 50 μm) de acuerdo con el patrón de cromatografía (por ejemplo, clar, gc), una distribución estrecha del tamaño de las partículas (por ejemplo, PDI < 1,2) puede mejorar la uniformidad del relleno.

- tratamiento de la superficie: Los rellenos de matriz de silicona deben ajustar el pH para evitar la adsorción estática; Los rellenos C18 altamente hidrofóbicos deben preimpregnados con metanol o nitrilo para reducir la aglomeración.

- desembalación y dispersión: la suspensión de relleno necesita desgasificación por ultrasonido para evitar que las burbujas formen agujeros durante el proceso de llenado; El homogeneizado de alta viscosidad puede agregar una cantidad adecuada de tensoactivo (como el alcohol isopropílico) para mejorar la dispersión.

2. pretratamiento de la columna cromatográfica

- limpieza y secado: las columnas deben limpiarse con metanol, tolueno y otros disolventes para eliminar los restos metálicos o el aceite, y luego soplar nitrógeno o secarse al vacío.

Tratamiento de la cara final: la rugosidad de la entrada y salida de la tubería debe ser inferior a 0,1 micras para evitar fugas de relleno; Se pueden aplicar recubrimientos inertes como poliimida para mejorar la estanqueidad.

II. método de llenado

1. relleno húmedo (slurry packing)

Preparación de homogeneización: mezclar el relleno con un disolvente (como metanol / agua, nitrilo / agua) para preparar una suspensión con un contenido sólido del 5% al 30%, y oscilar por ultrasonido durante 10 - 30 minutos para garantizar una dispersión uniforme.

- llenado de la bomba de flujo constante: inyección de homogeneización en el tubo de la columna a través de la bomba de flujo constante de alta presión, el caudal suele ser de 5 - 20 ml / min, y la presión de la columna se controla en 60 - 120 bar. Durante el proceso de llenado, es necesario golpear continuamente la pared de la columna, liberar burbujas de aire y promover la acumulación densa de relleno.

- descarga de gradiente: reducir lentamente el caudal a 0,1 ml / MIN después de completar el relleno y mantenerlo durante 10 - 15 minutos para estabilizar la estructura de la cama de columna.

2. método de llenado de homogeneización (slurry - efluent packing)

- llenado de equilibrio dinámico: bombear la suspensión de relleno en el tubo de la columna simultáneamente con el líquido de reemplazo (como el disolvente puro) y utilizar la diferencia de densidad para lograr el asentamiento estratificado. Por ejemplo, el relleno C18 puede usar metanol como líquido de reemplazo, mientras que el relleno de silicona debe coincidir con la Polar del disolvente.

- control de temperatura: el calentamiento a 40 - 60 ° C puede reducir la viscosidad del disolvente y acelerar el asentamiento del relleno; Solidificar el lecho de la columna después de enfriarse a temperatura ambiente para evitar el agrietamiento causado por la expansión térmica.

3. relleno seco (dry packing)

- escenarios aplicables: principalmente para rellenos de gran tamaño de partícula (por ejemplo, 50 - 200 μm) o rellenos de forma especial (por ejemplo, columnas enteras).

- asentamiento por gravedad: verter lentamente el relleno en el tubo de la columna, golpear ligeramente la pared de la columna y complementarlo con una mesa de vibración para que el relleno se acumule naturalmente y densamente; Después de colocar la placa de tamiz poroso en la parte superior, presione a 5 - 10 bar para solidificar.

III. tratamiento posterior al llenado

1. detección y corrección de camas de columna

- pruebas ópticas: observar la uniformidad de la cama de la columna mediante el método de transmisión de luz o el microscopio electrónico de barrido, y si hay grietas o canales, es necesario volver a trabajar y reinstalar.

Prueba de caudal: lavar la columna con disolvente puro y registrar la contrapresión; La presión de la columna ideal debe estar cerca del valor teórico (por ejemplo, la caída de presión de la columna clar ≤ 10% del valor teórico), y el aumento anormal sugiere defectos de llenado.

2. evaluación de la eficiencia de la columna

Verificación del estándar: inyección de sustancias de moléculas pequeñas como naftaleno y benceno, cálculo del número de placas de Torre (n > 10000 / m) y el factor de asimetría (as < 1,5) para garantizar que no haya zanjas ni zonas muertas en el lecho de la columna.

Prueba de estabilidad a largo plazo: 100 - 200 inyecciones consecutivas, monitorear los cambios en el tiempo de retención y el área pico, y evaluar el grado de bloqueo del relleno y la capacidad antiincrustante.

3. sellado y conservación

Bloqueo en ambos extremos: sellar el tubo de la columna con un tapón especial para evitar la entrada de contaminantes; El almacenamiento a largo plazo debe conservarse con un disolvente que contenga conservantes (como Azida de sodio al 0,05%).

- control ambiental: conservar a temperatura constante (15 - 25 ° c) para evitar la luz, las columnas de silicona deben ser estrictamente a prueba de humedad y las columnas de fase inversa deben evitar daños en la estructura del relleno causados por la congelación.

IV. puntos clave para el llenado de rellenos especiales

1. columna cromatográfica quiral: Los rellenos quirales recubiertos deben rellenarse en una atmósfera inerte para evitar la inactivación por oxidación; Los rellenos Unidos deben controlar el pH de llenado para evitar que los ligandos se caigan.

2. columna de electrocromatografía capilar: se rellena con polimerización in situ o por accionamiento electroquímico, que requiere un control preciso de la intensidad del campo eléctrico (por ejemplo, 50 - 200 V / cm) y la composición del amortiguador.

3. columna de cromatografía de ultra alta presión (uhpc): cuando se utiliza un relleno sub2 μm, se debe equipar con un tubo de columna con presión superior a 1200 bar, y se utiliza un líquido supercrítico (como co2) para ayudar a la compactación al cargar.