Como componente central del sistema de Cromatografía líquida de alto rendimiento (clar), el rendimiento de la columna de Cromatografía líquida afecta directamente la precisión y repetibilidad de los resultados del análisis. Después de un uso a largo plazo, la superficie de la fase fija acumulará gradualmente residuos de la muestra, cristales de sal tampón o sustancias fuertemente conservadas, lo que dará lugar a un ensanchamiento del pico, una disminución de la separación o incluso una presión Anormal. La limpieza y el mantenimiento científicos no solo pueden restaurar la eficiencia de la columna, sino también prolongar significativamente la vida útil de la columna cromatográfica. Los siguientes son los programas de limpieza sistemática y los puntos clave de operación para diferentes tipos de contaminación.
I. proceso básico de lavado y regeneración
1. método de elución de gradiente
- escenarios aplicables: contaminantes orgánicos convencionales (como proteínas, polipéptidos, metabolitos de moléculas pequeñas).
- pasos de operación:
① desconecte la conexión del detector para evitar que las impurezas de alta concentración entren en la piscina de circulación;
② con metanol - agua (50: 50, V / v) como disolvente inicial, el caudal se establece en 1 / 3 del caudal normal (ejemplo: columna ID de 4,6 MM se recomienda 0,8 ml / min);
③ aumentar gradualmente la proporción de fase orgánica al 95% de metanol y enjuagar continuamente durante 30 minutos;
④ recoger la tubería en sentido inverso, enjuagar a baja velocidad con cianuro puro durante 20 minutos y eliminar las impurezas hidrofóbicas utilizando el efecto de reemplazo del disolvente.
- parámetros clave: presión máxima de tolerancia ≤ 30 mpa, temperatura controlada por debajo de 40 ℃.
2. método de inmersión en disolvente fuerte
- para objetos: polímeros liposolubles o contaminantes de resina.
Detalles de la implementación:
Preparar una solución de alcohol propanol que contenga 0,1% de ácido trifluoroacético (tfa) y enjuagarla continuamente a baja velocidad de flujo (0,2 ml / min) durante la noche. El ambiente ácido puede promover la ionización y mejorar la capacidad de disolución de compuestos alcalinos. Tenga en cuenta que este método no es adecuado para columnas de fase vinculadas fuera de la matriz de silicona.
II. estrategias especiales de eliminación de la contaminación
1. eliminación por precipitación de sales inorgánicas
- características del fenómeno: aumento del ruido Basal y aparición de picos fantasmas.
- soluciones:
Se utiliza un tratamiento de dos pasos: ① enjuagar a baja presión con agua desionizada durante 30 minutos; ② cambiar a una solución metanol - agua que contenga 0,05 MOL / L de EDTA (ph ajustado a 7,0), secuestrar iones metálicos y disolver sedimentos de fosfato de calcio. La implementación de este procedimiento una vez al mes puede prevenir eficazmente los daños causados por la salinidad.
2. adsorción y disociación de biomoléculas
Análisis de dificultades: las sustancias nucleicos / proteicas son propensas a formar capas de adsorción irreversibles.
- procesos innovadores:
Equipado con una mezcla de SDS (sulfato de sodio de dodecilo) - propanol (0,1% en masa), con limpieza asistida por choque ultrasónico. La frecuencia de ultrasonido se selecciona en 40 khz, y la amplitud se ajusta a justo producir burbujas de cavidad de nivel micro, que no sólo pueden quitar la capa de adhesión, sino también no destruir el esqueleto de silicona. Después de la finalización, es necesario reemplazar el tensoactivo con una gran cantidad de agua pura.
3. tratamiento de emergencia en condiciones especiales de trabajo
Cuando se encuentra con un bloqueo grave, se pueden utilizar los siguientes medios no convencionales:
1. lavado de pulso de alta tensión inversa
- poner la columna invertida en el sistema, establecer el modo de pulso (presión máxima de 40 mpa, duración inferior a 5 segundos / vez), inyectar aire a intervalos para impulsar la descarga de partículas residuales. Este método se limita al uso inicial de la contaminación por óxido metálico, y el funcionamiento frecuente puede causar colapso del relleno.
2. regeneración de tostado a alta temperatura in situ
- columna cromatográfica especial adecuada para la preparación de rellenos cerámicos resistentes a altas temperaturas. Se calienta lentamente a 300 ° C y se mantiene durante 2 horas, lo que oxida la carbonatación. El proceso de enfriamiento debe controlar estrictamente la tasa de enfriamiento (≤ 5 ℃ / min) para evitar grietas por estrés térmico.
IV. protección diaria y gestión a largo plazo
1. pretratamiento antes de la inyección
Todas las muestras deben ser filtradas por una membrana filtrante de 0,22 micras, y se recomienda el uso de un dispositivo de protección con precolumna para interceptar impurezas de partículas. Para muestras de matriz compleja, se recomienda conectar columnas de extracción en fase sólida en línea para la purificación preliminar.
2. optimización de las condiciones de almacenamiento
- parada a corto plazo (> 7 días): conservar en una solución de metanol - agua (80: 20), sellada en ambos extremos para evitar la volatilización;
Sellado a largo plazo: cargar nitrógeno para crear una atmósfera inerte y colocarlo en un secador para evitar la luz y conservarlo. Revisar regularmente las tendencias de cambio de la presión de la columna y establecer archivos del ciclo de vida.
3. aplicación del sistema de monitoreo inteligente
Equipado con sensores de presión para monitorear la diferencia de presión entre la entrada y la salida en tiempo real, activando automáticamente el procedimiento de lavado cuando△psupera el umbral de alerta (generalmente 1,5 veces el valor inicial). Combinado con el grado de atenuación de la señal del detector ultravioleta, se evalúa dinámicamente el Estado de atenuación de la eficiencia de la columna.