En la preparación de la cromatografía líquida, la columna protectora es la primera línea de defensa para proteger la columna de análisis principal, que actúa para absorber las impurezas en la muestra (como partículas, componentes fuertemente reservados, perturbadores de matriz, etc.) y evitar la contaminación o bloqueo de la columna principal. Debido a que la preparación de la fase líquida generalmente trata muestras de alta concentración y gran volumen, la pérdida de la columna protectora es más rápida, por lo que el método de mantenimiento científico es crucial para prolongar su vida útil y garantizar la eficiencia de la separación. Las siguientes son las estrategias de mantenimiento y los puntos clave de operación para la preparación de columnas de protección de fase líquida:

I. el papel y el mecanismo de pérdida de la columna protectora

1. funciones básicas

Interceptar partículas en la muestra (como sólidos no disueltos, partículas) para evitar el bloqueo de la placa de tamiz en la entrada de la columna principal;

- la fuerte adsorción conserva impurezas (como ingredientes liposolubles, proteínas, etc.) para evitar la contaminación de la fase fija de la columna principal;

Estabilizar la frontera de la fase móvil y reducir el impacto directo de la muestra con la columna principal.

2. causas de la pérdida

- obstrucción física: acumulación de partículas diminutas o sustancias coloidales en la muestra;

Sobrecarga de adsorción química: las impurezas de alta concentración rompen el límite de capacidad de la columna protectora;

- contaminación biológica: los residuos de proteínas y microorganismos provocan una disminución de la eficiencia de la columna (especialmente en los sistemas acuáticos);

Erosión de la fase móvil: disolventes incompatibles (como ácidos / bases fuertes) destruyen la estructura de relleno de la columna protectora.

II. especificaciones de las operaciones diarias de mantenimiento

1. preparación antes de la instalación

Confirmación de la dirección: la dirección de la flecha de identificación de la columna de protección debe ser consistente con la dirección de la fase de flujo para evitar la pérdida de relleno causada por la reinstalación;

- Inspección de la articulación: utilice una articulación de volumen muerto cero adaptada al diámetro de la columna (por ejemplo, 1 / 16 pulgadas o 1 / 8 pulgadas) para evitar la difusión de vórtice;

- activación inicial: la nueva columna protectora debe equilibrarse adecuadamente con la fase móvil objetivo (se recomienda un caudal de 5 - 10 ml / min y un volumen de lavado ≥ 30 ml) para expulsar el aire del relleno.

2. optimización del preprocesamiento de muestras

- filtración y eliminación de impurezas: la muestra debe filtrarse por una membrana filtrante de 0,22 micras para eliminar las partículas suspendidas;

- Aclaración centrífuga: centrifugación de alta velocidad de muestras turbias (por ejemplo, 10000 rpm, 10 minutos) y inyección de líquido sobrenadante;

Control de dilución: las muestras de alta concentración deben diluirse dentro del rango de capacidad de absorción de la columna protectora para evitar sobrecarga instantánea.

3. gestión de la fase móvil

- compatibilidad del pH con el disolvente: Los rellenos de columnas protectoras (como c18, scx, etc.) deben coincidir con el rango de pH de la fase móvil (generalmente 2 - 8) para evitar la corrosión ácida / alcalina fuerte;

Lavado después de la elución del gradiente: si se utiliza la elución del gradiente, es necesario lavar la columna protectora con fase móvil inicial ≥ 10 ml después del final para evitar la salinización o los residuos de sustancias hidrofóbicas;

- gestión de la sal tampón: las fases móviles que contienen sal tampón deben ser lavadas regularmente con agua en lugar de agua para evitar el bloqueo de la cristalización de sal.

4. monitoreo de presión y protección de restricción de flujo

- configuración del umbral de diferencia de presión: la caída normal de presión de la columna protectora es generalmente de 1 - 3 bar (velocidad de flujo de 10 ml / min), si la diferencia de presión aumenta repentinamente en más del 50%, se indica el riesgo de bloqueo;

Estrategia de reemplazo: dependiendo de la complejidad de la muestra, se recomienda reemplazar obligatoriamente la columna protectora después de cada 50 - 100 inyecciones procesadas.

III. regeneración y restauración de columnas de protección

1. método de regeneración química

- lavado inverso: para las columnas protectoras saturadas de adsorción, se puede lavar inversamente con disolventes orgánicos altos (como metanol y nitrilo), con un caudal de 5 - 10 ml / min, un volumen de lavado ≥ 50 ml y una elución de impurezas débilmente adsorbidas;

- regeneración de elución por gradiente: para las impurezas fuertemente retenidas, se utiliza elución por gradiente (como el gradiente metanol - agua), se aumenta gradualmente la proporción de fases orgánicas y se enjuaga por etapas;

- limpieza con disolvente especial: las impurezas liposolubles se pueden lavar con alcohol isopropílico o tetrahidrofurano, y la contaminación por proteínas se puede lavar con una solución de agua TFA del 0,1%.

2. medios de reparación física

- asistencia por ultrasonido: extracción del relleno de la columna protectora (si es necesario), inmersión en el disolvente y tratamiento por ultrasonido durante 10 - 15 minutos, rellenar;

- limpieza de la placa de tamiz: retire la placa de tamiz de entrada y salida, Enjuague con un cepillo suave o agua ultrapura y retire las partículas incrustadas.

3. verificación del efecto de regeneración

- prueba de eficacia de columna: inyección de sustancias de referencia (como benceno y naftaleno) después de la regeneración para detectar si el número de placas de Torre vuelve a más del 80% del valor inicial;

- línea de base en blanco: enjuagar con fase móvil hasta que la línea de base sea estable, sin pico fantasma o fenómeno de arrastre.

IV. momento de almacenamiento y reemplazo de la columna de protección

1. suspensión del uso a corto plazo

- conservación húmeda: rellenar la columna protectora con fase móvil inicial o solución de metanol - agua (1: 1) y sellar y evitar el secado en ambos extremos;

- protección contra la luz a baja temperatura: se recomienda una temperatura de almacenamiento de 4 - 25 ° C para evitar daños en la estructura del relleno debido a la congelación.

2. tratamiento de desactivación a largo plazo

- limpieza: enjuagar con metanol, agua y metanol a su vez para eliminar la sal tampón y los residuos de materia orgánica;

- conservación en seco: después de soplar nitrógeno o secarse al vacío, conservar sellado en un secador.

3. cambiar los criterios de juicio

- diferencia de presión anormal: caída de presión superior al doble del valor inicial a la misma velocidad de flujo;

- disminución de la separación: desviación del tiempo de retención del pico principal superior al 10% o cola severa de la forma del pico;

Penetración de impurezas: contaminación anormal en la columna principal (como residuos de picos desconocidos), es necesario reemplazar la columna protectora después de descartar otros factores.

V. precauciones y malentendidos comunes

1. evitar la "protección excesiva"

- la columna protectora no es omnipotente y si la concentración de impurezas de la muestra es alta (como el extracto grueso), es necesario conectar varias columnas protectoras en serie o dar prioridad al pretratamiento fuera de línea (como la extracción en fase sólida).

2. se prohíbe el funcionamiento de columnas secas

El secado de la columna protectora puede causar grietas en el relleno, cambios en la trayectoria del flujo de agua y la necesidad de mantenerse siempre húmedo.

3. no opere por encima de la velocidad de flujo

- el caudal de la fase líquida de preparación es alto (generalmente 10 - 50 ml / min), pero el caudal de la columna protectora debe coincidir estrictamente con su límite superior de diseño (como el valor de resistencia a la presión del relleno) para evitar daños mecánicos.

4. registrar el registro de mantenimiento

Registrar la diferencia de presión, el disolvente de lavado, el número de regeneración y la fecha de reemplazo después de cada uso para proporcionar soporte de datos para la optimización posterior.