Lisador de péptidosLa operación y el uso cubren cinco enlaces básicos: calibración y preparación del equipo, procesamiento de reactivos y muestras, ejecución de reacciones de craqueo, purificación de productos y mantenimiento del equipo.Lisador de péptidosLos pasos operativos específicos y las precauciones son los siguientes:
I. calibración y preparación del equipo
Inspección de integridad de los componentes
Antes de arrancar, verifique si el cable de alimentación, el reactor, la bomba, la válvula y otros componentes están intactos para asegurarse de que no hay daños ni aflojamientos. Por ejemplo, si se descubre que el anillo de sellado del reactor está envejecido, es necesario reemplazarlo inmediatamente para evitar fugas de gas durante el proceso de craqueo.
Asegúrese de que la botella de almacenamiento de disolvente está estrechamente conectada a la tubería de gas y no hay fugas. Compruebe si la presión del aire comprimido (air) es de 60 - 100 PSI y la presión del nitrógeno (n2) es de 5 - 10 psi.
Calibración de parámetros
De acuerdo con las necesidades experimentales, se preestablecen parámetros como la temperatura de craqueo, la presión y la velocidad de flujo. Por ejemplo, la temperatura debe controlarse con precisión en 37 ° C cuando se descompone la enzima, y el rango de fluctuación no debe exceder ± 0,5 ° c.
Calibrar regularmente el sensor de temperatura (cada seis meses, el error debe controlarse dentro de ± 0,2 ° c) y el sensor de presión (una vez al año) para garantizar la precisión de los datos.
Precalentamiento del equipo
Encienda la fuente de alimentación del sintético y precaliente el equipo a la temperatura de reacción establecida. El tiempo de calentamiento varía según el modelo del equipo y la temperatura, por lo que hay que esperar pacientemente.
II. reactivos y tratamiento de muestras
Preparación del reactivo
Preparar el lisado (por ejemplo, TFA / agua / trimetilsilano = 95: 2,5: 2,5), reactivos de activación (por ejemplo, hbtu, dcc), disolventes (dmf, dcm), etc.) para garantizar que todos los materiales sean frescos y puros y evitar la introducción de impurezas.
Confirme que el reactivo no tiene precipitación o deterioro, se recomienda filtrar el reactivo antes de su uso y marcar la fecha de apertura, y el reactivo caducado se desecha a tiempo.
Pretratamiento de muestras
Las muestras de alta viscosidad o que contienen partículas se pretratan con centrifugación, filtración, etc., para evitar bloquear la Cámara de craqueo o dañar el cuerpo de la bomba. Por ejemplo, las muestras no pretratadas pueden provocar un aumento del 40% en la tasa de desgaste del cuerpo de la bomba.
III. ejecución de la reacción de craqueo
Fijación de resina y aminoácidos
Elija un portador sólido adecuado (como rink amide resin), use una resina de hinchazón de Diclorometano (dcm), retire las impurezas y seque para su uso posterior.
El aminoácido objetivo se mezcla con el reactivo de activación, se forma un éster activo y se pone en el reactor para unirse al aminogrupo desprotegido para formar un enlace péptido.
Reacción de craqueo
Agregue el lisado preconfriado (como la mezcla tfa) y revuelva a temperatura ambiente durante 2 horas. Durante el proceso de craqueo, es necesario monitorear la temperatura, la presión y otros parámetros en tiempo real, y detener la inspección a tiempo si se encuentran anomalías.
Después de la craqueo, se libera el líquido de reacción, se filtra por extracción para eliminar la resina y se lava la resina tres veces con un disolvente como TFA para fusionar el filtrado.
IV. purificación de productos
Concentración y precipitación
El lisado se transfiere al evaporador rotativo para condensarlo a temperatura ambiente a un volumen pequeño, y se añade el éter de metilterc - butilo (mtbe) para precipitar el péptido.
La precipitación se recoge por centrifugación (10000rpm, 10 minutos), se lava tres veces con éter frío y se seca para obtener péptidos gruesos.
Purificación por Cromatografía líquida de alto rendimiento (clar)
La purificación se llevó a cabo con una columna de fase inversa c18, con una fase móvil a del 0,1% TFA / agua y una fase móvil B del 0,1% TFA / nitrilo. En condiciones de elución gradiente (la fase B sube del 10% al 60% en 0 - 30 minutos), se recoge el pico objetivo.
Después de la purificación por clar, la pureza del péptido puede aumentar del 85% al 98%.
V. mantenimiento y mantenimiento del equipo
Limpieza diaria
Después de cada uso, lave la pared interior del reactor con agua desionizada para eliminar el lisado residual y los fragmentos de proteínas. Para las manchas obstinadas, se pueden remojar con detergente enzimático y cepillarlas.
Desinfectar semanalmente las tuberías con etanol al 75% o solución de hipoclorito de sodio al 0,1% para evitar la cría microbiana. Después de la desinfección, es necesario secar la tubería con nitrógeno.
Reemplazo de piezas vulnerables
Compruebe la elasticidad del anillo de sellado cada 3 meses y reemplace inmediatamente si hay endurecimiento o grietas. Reemplazar el filtro de admisión de aire cada 1 - 2 meses para evitar que el polvo entre en el interior del equipo.
Llene trimestralmente los componentes móviles como el cuerpo de la bomba y la válvula con lubricantes especiales (como la grasa a base de silicio) para reducir la fricción y el desgaste.
Gestión del almacenamiento a largo plazo
Cuando no se utiliza el equipo, almacénelo en un lugar seco, ventilado y protegido de la luz, evitando la luz solar directa y el ambiente húmedo. Asegúrese de que el equipo esté alejado de gases y líquidos corrosivos.
Aplicar aceite antioxidante (como vaselina) en la superficie metálica del equipo y cubrir la cubierta de polvo.