El principio técnico y el proceso de operación del instrumento de impresión de proteínas nacionales multicanal (instrumento westernblotting) dependen principalmente de su capacidad de detección de proteínas eficiente y precisa. Western blot es una tecnología experimental utilizada para detectar y analizar la expresión de proteínas específicas, que es ampliamente utilizada en biología molecular, investigación médica y otros campos.
Los siguientes son los principios técnicos y el proceso de operación del imprint nacional multicanal:
Principios técnicos
El principio básico de la impresión de proteínas es separar las proteínas de la muestra por tamaño de peso molecular a través de la página de gel y transferir las proteínas separadas a la membrana a través de la membrana giratoria. Luego, a través de la Unión a anticuerpos específicos en la membrana, se detecta la presencia y expresión de proteínas.
El imprint multicanal mejora principalmente la eficiencia experimental mediante el procesamiento paralelo de múltiples canales de muestra en un solo instrumento. Sus principios técnicos básicos incluyen:
Separación de proteínas:
Gel - page: las proteínas de la muestra se separan a través de la página de gel de poliacrilamida. las proteínas con menor peso molecular migran más rápido en el campo eléctrico y las proteínas más grandes migran más lentamente, logrando así la separación por tamaño.
Transferencia de proteínas:
Membrana giratoria: la proteína separada se transfiere del gel a la membrana (generalmente película PVDF de polifluoruro de vinilideno o película de nitrato de celulosa) a través de la transferencia eléctrica (método de electrolisis). Las proteínas de la membrana se fijan en una posición específica.
Detección de proteínas:
Incubación de anticuerpos: mediante el uso de anticuerpos específicos (generalmente anticuerpos contra la proteína objetivo), los anticuerpos se unen a la proteína objetivo en la membrana.
Quimioluminiscencia o reacción de color: un anticuerpo secundario marcado con una enzima se une a la proteína objetivo y genera señales a través de una reacción de Quimioluminiscencia o reacción de color, detectando la presencia y expresión de la proteína a través de un sistema de imágenes.
Tecnología multicanal:
El analizador de impresión de proteínas multicanal puede procesar múltiples canales de muestra simultáneamente en el mismo proceso experimental sobre la base de la impresión tradicional de proteínas de canal único. Esto se logra a través de múltiples agujeros de muestra y operaciones paralelas, lo que mejora la eficiencia del experimento y la comparabilidad de los datos.
Proceso de operación
El proceso de operación del imprint nacional multicanal generalmente incluye los siguientes pasos principales:
1. preparación de muestras
Recoger muestras de células o tejidos a detectar.
Romper las células con un amortiguador de lisis para extraer proteínas.
Cuantificar las proteínas extraídas para asegurarse de que se añadan cantidades iguales de proteínas a cada muestra.
2. SDS - Page
Preparación de geles de poliacrilamida, generalmente con geles SDS - page, SDS (sulfato de sodio de dodecilo) se utiliza para destruir la estructura de las proteínas, haciéndolas cargadas negativamente y separadas por tamaño de peso molecular.
Las muestras se cargan en geles y se depositan en campos eléctricos para separar proteínas de diferentes pesos moleculares.
3. película giratoria
Las proteínas del gel se transfieren a la membrana PVDF o a la membrana de nitrato de celulosa. El proceso de transferencia de película se realiza generalmente a través de la transferencia eléctrica.
Utilizando un instrumento de membrana giratoria (como la unidad de membrana giratoria en el imprint de proteína multicanal), se ajustan parámetros como la corriente eléctrica, el voltaje y el tiempo de transferencia para garantizar que la proteína se transfiera a la membrana de manera eficiente y uniforme.
4. bloqueo
Trate la película con una solución de cierre (como leche desnatada en polvo al 5% o solución bsa) y cierre los sitios de unión no específicos para evitar que los anticuerpos se unan al resto de la película.
5. incubación de anticuerpos
Una anticoronación: poner la membrana en una solución anticorona es generalmente un anticuerpo primario específico para la proteína objetivo. El tiempo de incubación puede ser de 1 hora a la noche, dependiendo de las características de los anticuerpos.
Incubación de anticuerpos secundarios: incubación con anticuerpos secundarios marcados con enzimas (como la superóxidasa de rábano picante hrp) u otras moléculas detectables para mejorar la señal.
6. detección de Quimioluminiscencia
La enzima HRP cataliza la luminiscencia del sustrato cuando se reacciona con un sustrato quimioluminiscente, como un reactivo ecl.
Se utilizan sistemas de imágenes, como los sistemas de imágenes de quimioluminiscencia, para capturar señales luminosas y generar imágenes de detección de proteínas.
El diseño multicanal del imprint multicanal permite la captura simultánea de señales de varias muestras, lo que mejora la eficiencia.
7. análisis de datos
Los niveles de expresión de las proteínas se analizan en función del brillo y el tamaño de las bandas detectadas. La intensidad de la banda es proporcional a la cantidad de expresión de la proteína objetivo.
El análisis cuantitativo de las bandas se realiza con software y se compara con la escala de proteína estándar para calcular la expresión relativa de las proteínas.
Ventajas y características
Operación paralela multicanal: se pueden procesar varias muestras al mismo tiempo, lo que mejora la eficiencia del trabajo y la comparabilidad de los datos.
Alto grado de automatización: reducir el error humano a través del control automático del instrumento de la película giratoria, la incubación de anticuerpos, el lavado y otros pasos.
Alta sensibilidad y Alto rendimiento: adecuado para la detección de proteínas de baja abundancia y capaz de procesar un gran número de muestras.
Amplia gama de aplicaciones: se puede aplicar a una variedad de experimentos, como el análisis de la expresión de proteínas, la verificación de la especificidad de anticuerpos, el estudio de la interacción proteína - proteína, etc.
conclusión
El medidor de impresión de proteínas nacional multicanal mejora en gran medida la eficiencia y precisión del experimento de impresión de proteínas a través de un proceso de operación eficiente y automatizado. Proporciona a los investigadores herramientas de detección de proteínas de mayor rendimiento y rapidez, especialmente cuando es necesario procesar varias muestras al mismo tiempo, mostrando ventajas significativas.