La PCR fluorescente en tiempo real (qpcr) monitorea el proceso de amplificación de ADN en tiempo real a través de señales fluorescentes, y su interpretación de datos requiere un análisis integral combinado de la curva de amplificación, el valor CT y la curva de fusión.

Puntos centrales de la interpretación de datos

Análisis de la curva de amplificación

La curva de amplificación normal debe ser de tipo "s", incluyendo el período de referencia, el período exponencial y el período de plataforma. Si la curva presenta una deformación temprana de la cola (amplificación no específica) o fluctuaciones tardías del período de plataforma (enfriamiento por fluorescencia), puede indicar la degradación del Dímero de primer o del reactivo. Por ejemplo, el uso de sondas caducadas en un laboratorio ha provocado una disminución de la eficiencia de amplificación del 30% de las muestras.

Determinación del valor CT

El valor CT (número de ciclos de umbral) refleja la cantidad inicial de plantilla y es necesario asegurarse de que cae dentro del rango lineal de la curva estándar (generalmente 15 - 35 ciclos). Si el valor de CT es anormalmente bajo ( < 15), puede haber contaminación; Si es alto (> 35), es necesario investigar la degradación de la muestra o la eficiencia de extracción. Una prueba clínica encontró que después de que las muestras de sangre se almacenaron durante más de 48 horas, los valores de TC retrasaron un promedio de 3 circulaciones.

Verificación de la curva de fusión

La curva de fusión de pico único (el valor de Tm es consistente) indica una amplificación específica, y los picos dobles o múltiples sugieren un Dímero de primer o un producto no objetivo. Por ejemplo, en la prueba sybrgreen, si la temperatura de fusión se desvía de lo esperado (por ejemplo, el producto objetivo Tm = 82 ° c, el pico real de 78 ° c), es necesario rediseñar el primer.

Problemas y soluciones comunes

No hay retraso en la amplificación o amplificación

Causas: degradación de la plantilla, falla de los primeros y actividad enzimática insuficiente.

Solución: volver a extraer ADN / arn, usar Primers frescos y empaquetar reactivos enzimáticos para evitar la congelación y descongelación repetidas.

Amplificación no específica

Causa: mal diseño del primer y temperatura de recocido demasiado baja.

Solución: optimizar el primer (contenido de GC 40 - 60%, longitud 18 - 22 bp) y aumentar la temperatura de recocido en 5 ° c.

Poca repetibilidad

Causa: error de muestra, fluctuación del control de temperatura del instrumento.

Solución: utilice la pistola de drenaje para agregar muestras y calibrar el instrumento regularmente (por ejemplo, precisión de temperatura ± 0,2 ° c).

Señal fluorescente anormal

Causa: falta de tinte de referencia rox, dislocación del filtro.

Solución: complementar el tinte rox e inspeccionar el sistema de circuito óptico del instrumento.

Recomendaciones de control de calidad

Cada experimento estableció un control negativo (sin plantilla) y un control positivo (plantilla de concentración conocida).

El valor de la curva estándar R m2 debe ser ≥ 0,99, y la eficiencia de amplificación se mantiene en el 90 - 110%.

Limpie regularmente el camino de luz del instrumento para evitar que el polvo afecte la detección fluorescente.

A través del análisis sistemático de la morfología de la curva de amplificación, la distribución del valor CT y las características de la curva de fusión, combinada con estrictas medidas de control de calidad, se puede mejorar significativamente la fiabilidad y repetibilidad de los datos qpcr.