Para resolver este problema, el equipo de desarrollo diseñó una plataforma de imágenes de fluorescencia multimodal que integra el sistema de navegación por fluorescencia de campo ancho (wf - nav) con imágenes microscópicas de dos fotones miniaturizadas y imágenes microscópicas de tres fotones miniaturizadas. Para aprovechar al máximo las ventajas de la excitación de un solo fotón, el sistema WF - NAV está equipado con funciones de gran campo de visión y resolución de una sola célula, que pueden identificar rápidamente áreas de interés designadas. Una vez posicionado en la región objetivo, el sistema puede cambiar sin problemas a imágenes de dos o tres fotones, logrando aún más una alta relación señal - ruido o imágenes de neuronas profundas. Posteriormente, la sonda m2pm o m3pm se fijó en la cabeza del ratón y se liberó al ratón para la imagen de movimiento libre.

Figura 1. diseño del sistema de imágenes fluorescentes multimodal

El sistema WF - NAV consta de un microscopio de campo ancho de gran campo de visión multicolor y un conector multifuncional. El sistema utiliza tres LED como fuente de luz estimulada (405 nm, 473 nm, 561 nm) y está equipado con una lente de concentración asférica de alta Apertura numérica para colimar el haz led, cada camino de luz estimulada está equipado con el Grupo de filtros correspondiente. Con el fin de lograr la navegación de gran campo de visión y proporcionar suficiente espacio para cambiar sin problemas el Grupo de lentes multiphoton, el equipo de desarrollo diseñó una lente seca de larga distancia de trabajo y baja tasa de duplicación. El objetivo (3.3x) utiliza un diseño anti - teleobjetivo: el Grupo delantero proporciona un enfoque óptico negativo para dos lentes binarias pegadas, y el Grupo trasero está compuesto por una lente esférica única. Esta estructura mueve el plano principal hacia atrás para corregir la diferencia de color, logrando una distancia de trabajo de longitud focal efectiva súper larga manteniendo la apertura numérica, y finalmente alcanzando un indicador de avance de una distancia de trabajo de 90 mm, y logrando un campo de visión máximo de imagen de Phi 5,64 mm.

Figura 2. diseño del microscopio fluorescente de campo ancho

Para lograr una conmutación perfecta entre el modo de campo ancho y el modo de imagen multiphoton, el equipo diseñó un conector multifuncional. El conector conecta el objetivo de campo ancho y ajusta la distancia focal en la plataforma eléctrica del eje Z. A través del diseño estandarizado de la sonda m2 / 3pm, la sonda se puede instalar firmemente en el mismo soporte y garantizar la imagen de enfoque homogéneo cuando se cambia el modo de campo múltiple y ancho.

Figura 3. adaptadores multifuncionales y función de enfoque

Este objetivo de 90 mm de distancia de trabajo proporciona suficiente espacio para operar la cabeza, la fibra óptica o instalar un módulo de lente zoom eléctrico extraíble. El soporte de la cabeza se instala en un deslizamiento de bola lineal ligero con poca resistencia al deslizamiento (aproximadamente 0,1n) y una distancia telescópica de 12 mm, lo que puede evitar eficazmente el riesgo de colisión entre el objetivo y la muestra. Al reemplazar el soporte de la cabeza, el sistema es compatible con diferentes cabezas, como mini2p y m3pm. Además, gracias al tamaño y al diseño retractable del microscopio de dos fotones miniaturizado, el sistema ofrece un mayor ángulo de observación en la mayoría de las direcciones en comparación con los objetivos de escritorio convencionales, lo que aporta un mayor alcance de Observación de muestras. Este diseño mejora significativamente la eficiencia del posicionamiento grueso de las muestras.

Figura 4. comparación de los ángulos de Observación de diferentes lentes y microscopía de dos fotones miniaturizada

A continuación, los desarrolladores evaluaron las propiedades ópticas y las aplicaciones prácticas del microscopio fluorescente de campo ancho. Las secciones cerebrales de los ratones thy1 - ypfh se pueden identificar claramente como neuronas y axones. La imagen de iones de calcio vivos se realizó a una longitud de onda de 470 nm y la imagen morfológica a una longitud de onda de 561 nm, capturando con éxito 3.804 neuronas marcadas con gcamp6f y 4.650 astrocitos de ratón que expresaban mccherry. Estos resultados demuestran que el microscopio de campo ancho tiene capacidades de imagen multicolor, de resolución unicelular y de alto rendimiento, y proporciona un excelente rendimiento en la navegación de áreas objetivo de interés.

Video 5. imagen de alto rendimiento del microscopio de campo ancho miniaturizado

Para que las imágenes de m2pm en ratones libres funcionen sin problemas, los desarrolladores han establecido un proceso de imagen estandarizado para mejorar la eficiencia de las imágenes de m2pm en animales libres. Primero se realizan inyecciones virales y operaciones quirúrgicas en animales, como la implantación de ventanas craneales o la implantación de Grin lens, y luego se espera 2 - 4 semanas para garantizar la plena expresión del virus y la recuperación de las lesiones quirúrgicas. En el caso de un experimento, Etiquetamos gcamp6s y mccherry en neuronas de la corteza motora primaria (m1), y luego fijamos el ratón a una cinta de correr bajo el dispositivo WF - nav. A continuación, la región de interés del objetivo se localiza a través de un microscopio de campo ancho y se apunta al Centro del campo de visión. Posteriormente, se cambia al modo m2pm a través del sim, se realiza una imagen bicolor de dos fotones a 920 nm y 1030 nm de longitud de onda, y finalmente se realiza un ajuste fino del eje XY y el plano focal, que permite confirmar la región objetivo final en unos minutos. En la mayoría de los casos, el plano focal del objetivo se eleva unos 25 micras para compensar el desplazamiento del foco causado por la contracción del cemento, y luego se fija la base a la cabeza del animal, que después de unos 10 minutos de solidificación permite a los ratones realizar imágenes de movimiento libre.

Figura 6. proceso estandarizado de Micrografía de dos fotones en miniatura de libre movimiento

Los desarrolladores validaron el sistema a través de imágenes de señales y estructuras de calcio de las neuronas en experimentos sociales con ratones, y todo el proceso de instalación duró unos 20 minutos, con una tasa de éxito del 100% (n = 15), que incluso investigadores inexpertos pudieron dominar fácilmente, lo que mejoró enormemente la eficiencia experimental. Además, se repitieron varios días imágenes de neuronas y astrocitos de la segunda capa de la región m1, y los resultados mostraron que el registro del campo visual era estable sin reinstalar la base.

Figura 7. imágenes del mismo campo de visión durante varios días

Gracias al diseño mecánico estandarizado, la cabeza de imagen m3pm se puede instalar fácilmente en el soporte. La aplicación de adaptadores multifuncionales permite un cambio sin problemas del modo de campo ancho al modo de imagen de tres fotones. Debido a las limitaciones de la profundidad de imagen del microscopio de un solo fotón de campo ancho, las señales profundas a menudo son difíciles de detectar; Aunque los vasos sanguíneos superficiales pueden servir como cierta referencia, el área de inyección del virus que conserva la superficie puede proporcionar Marcas fluorescentes más directas y ayudar a alinear las partes más profundas en el eje vertical. En ratones con cabeza fija y expresión de gcamp6f, los desarrolladores registraron con éxito la actividad neuronal en la región de postsubicum desde la superficie de la corteza hasta una profundidad de 1020 micras, y realizaron experimentos de exploración del comportamiento de campo abierto en ratones, registrando la actividad de señal de calcio a una profundidad de 670 micras durante mucho tiempo.

Figura 8. imágenes miniaturizadas de fijación de tres fotones y comportamiento libre

El trabajo fue realizado por el Profesor Wu runlong (autor de la comunicación) de la Universidad de Ciencia y tecnología de la información de beijing, Wang Aimin y el Profesor Cheng Heping de la Universidad de pekín.

[referencias]

Wu R, Sun Y, Hao Z, et al. Sistema de navegación por fluorescencia de campo amplio para imágenes multifotónicas en miniatura eficientes en animales que se comportan libremente. Neurofotónica. 2025; 12(2):025018. doi:10.1117/1.NPh.12.2.025018