Cultivo en tándem de órganos intestinales e hepáticos para estudiar los procesos de absorción y toxicidad de los medicamentos

Para compensar las limitaciones de los modelos animales, se propone un nuevo modelo de evaluación de la seguridad de los medicamentos para * y reducir los modelos existentes. Con el fin de simular la absorción y el metabolismo de medicamentos en el sistema microscópico intestinal - hepático in vitro (mps) y predecir la Farmacodinámica y los efectos tóxicos, científicos del Instituto de evaluación de seguridad del Instituto de investigación de verificación de alimentos y medicamentos de China (centro nacional de monitoreo de evaluación de Seguridad de medicamentos), la Academia China de Ciencias médicas y la facultad de Medicina de la Unión de pekín, la compañía alemana tisuse gmbh, han colaborado para establecer un chip de cultivo en serie intestinal - hepática que detecta el proceso de lesión hepática aguda después de una sobredosis de apap (acetaminofén).Y fue publicado en la revista Food and Chemical Toxicology en septiembre de 2024.

Los organoides intestinales se establecieron utilizando líneas celulares Caco - 2 y ht29 - mtx - e12, mientras que los organoides hepáticos se establecieron utilizando hepg2, huvec - T1 y thp - 1 inducidos por pma, así como células estelares hepáticas humanas. La concentración de apap se determinó mediante Cromatografía líquida de alto rendimiento y los parámetros farmacocinéticos se ajustaron mediante análisis no atriales utilizando el software phoenix. Los cambios en los biomarcadores de lesiones hepáticas Aspartato transaminasa y Alanina transaminasa, así como en la albúmina, Biomarcador de la función hepática, indican que el cultivo a corto plazo de estos dos modelos de chips de órganos fue estable a los cuatro días. Después de la administración de acetaminofén (apap), la señal de oxígeno activo aumentó, mientras que el potencial de la membrana mitocondrial disminuyó, la Caspasa - 3 (caspasa - 3) se activó y la señal 53 aumentó, lo que indica que el exceso de apap desencadenó una respuesta tóxica. En el modelo de sistema multiorgánico del hígado intestinal, ajustamos los parámetros farmacocinéticos y SIMULAMOS el proceso de toxicidad hepática después del exceso de apap, lo que ayudará a la aplicación de chips de órganos en la detección de toxicidad farmacológica.

1. Introducción

La lesión hepática inducida por fármacos (dili) es el principal obstáculo para el desarrollo de medicamentos y puede conducir a la retirada de medicamentos del mercado (2021; 2016). Las diferencias entre los modelos animales y los humanos y los requisitos éticos cada vez más estrictos hacen necesario adoptar nuevos modelos de evaluación de la seguridad de los medicamentos (2014). Este sistema microscópico (mps), también conocido como "órgano en el chip", es un dispositivo construido combinando microfluídicos, micromabricación y Cultivo celular tridimensional (3d). Es capaz de reproducir funciones orgánicas fisiológicamente relacionadas para modelos animales. La plataforma MPS es un entorno fisiológico in vitro miniaturizado (shinohara y otros, 2021).

Esto permite simular y controlar con precisión los gradientes químicos y las fuerzas biológicas para simular el entorno corporal y responder. Los canales microfluídicos predefinidos actúan como vasos sanguíneos de ingeniería, recreando las funciones de los tejidos fisiológicos del cuerpo (bajo, etc., 2020) y permitiendo la Unión con otros sistemas multiorgánicos (kulthong, etc., 2020). Además, los sistemas multiorgánicos permiten el monitoreo de funciones tisulares en tiempo real (milani y otros, 2022).

El modelo de chip de múltiples órganos conectado en serie por microcanales es capaz de simular aún más las respuestas dinámicas humanas y las interacciones orgánicas internas (arakawa, etc., 2020) y proporcionar evidencia auxiliar sobre la relación entre la exposición al fármaco y la eficacia / toxicidad del fármaco. El intestino y el hígado son los principales órganos de absorción, distribución, metabolismo y excreción (adme), por lo que son muy importantes en el estudio de la Farmacodinámica (pk) (vernetti, entre otros, 2017).

Los medicamentos orales se absorben directamente en la sangre a través del tracto digestivo y los intestinos, lo que afecta la biodisponibilidad y la dosis sistémica del medicamento. El modelo de chip intestinal puede simular la absorción del fármaco y trazar la adme y las concentraciones en sangre del fármaco (milani, entre otros, 2022). Lee y otros (2017) construyeron un chip de hígado intestinal tridimensional para representar el modelo farmacocinético del acetaminofén (apap), mientras que Arakawa y otros (2020) construyeron un modelo de hígado intestinal para cálculos cuantitativos in vitro del metabolismo continuo de San zolam. Milani y otros (2022) evaluaron la cantidad de precursora farmacológica producida por el metabolismo intestinal e hepático del micofenolato. Por lo tanto, se pueden aplicar métodos similares a los MPS de otros órganos múltiples para estudiar los procesos farmacodinámicos en el cuerpo humano.

En la actualidad, solo se han reportado unos pocos ejemplos de sistemas de chips de múltiples órganos que realizan pruebas de toxicidad e identificación de muestras simultáneamente. Liu y otros (2020) han estudiado la absorción, el metabolismo y la toxicidad del complejo de Panax ginseng k a partir de un sistema de chips multiorgánicos basado en chips intestinales, vasculares, hepáticos y renales. Jeon y otros (2021) reportaron un chip enterohepático que recrea la absorción de ácidos grasos y la posterior acumulación de lípidos en el hígado.

Para explorar el sistema microscópico intestinal - hepático in vitro, aquí desarrollamos un chip de órgano dual intestinal - hepático repetible conectando un cultivo intestinal con una esfera hepática 3D construida con cuatro líneas celulares en serie en un chip de órgano dual (2oc). Analizamos la función del chip detectando los niveles de biomarcadores funcionales y proteínas, y luego probamos la toxicidad hepática en el chip agregando el compuesto hepatotóxico paracetamol (apap) a la cavidad intestinal para simular la toxicidad hepática después de la absorción del medicamento. Después de 48 horas de incubación, se detectaron la distribución del fármaco y las señales de toxicidad hepática en ambas cámaras.

2. materiales y métodos

2.1. Los recursos celulares y los métodos de cultivo se pueden ver en información complementaria.

2.2. Cultivo intestinal

Para construir un modelo intestinal en la placa de cultivo de transwell, las células Caco - 2 fueron inoculadas en la placa de cultivo de transwell (merck, pihp01250) con una densidad de 1 × 10 - 6 células por agujero. Las células Caco - 2 y ht29 - mtx - E12 se mezclaron en una proporción de 9: 1 y se inocularon en cada placa de cultivo a la misma concentración. Desde el día 0 hasta el día 7, el medio de cultivo se cambia cada dos días y una vez al día después del día 7.

2.3. Cultivo 3D (hígado)

Sobre la base de nuestro estudio anterior (sun y otros, 2024), las células thp - 1 se diluyeron en el medio rpmi 1640 a 5 × 10 - 5 células / ml, y luego se trataron durante 48 horas con 25 nanomoles de ácido fobo - acil acético (pma, medchemexpress) en una placa de 6 agujeros. Posteriormente, se cultivaron en el medio durante 24 horas y se seleccionaron con tryple (gibco), y se recolectaron células thp - 1 inducidas por pma. 2 HepG2、 Las células endoteliales de la vena umbilical humana t1, thp - 1 y las células estelares del hígado humano (hhsc) fueron recogidas después de la digestión, y la suspensión celular se mezcló en una proporción de 60: 19: 15: 6. Para formar la misma cantidad de células, 100 células se inoculan en cada agujero después de la dilución en una placa de 96 agujeros de pared baja en forma de u de fondo redondo (shenzhen Liver Biotechnology co., ltd., LV - ula002 - 96uw). Cambiar la mitad del medio de cultivo cada dos días. La morfología esférica se observó y midió con un analizador de imágenes celulares de alta connotación (perkin elmer, serie opereta).

2,4. Cocultivo intestinal - hepático basado en chips

La placa de 24 orificios huimic chip2 (tissuse gmbh, alemania) se preparó de acuerdo con el esquema recomendado (wagner y otros, 2013). A los 14 días posteriores al establecimiento del modelo intestinal, se agregó la incrustación celular de transwell a la Cámara de cultivo de 24 agujeros y se añadieron 50 esferas a la Cámara de cultivo de 96 agujeros para formar el modelo de chip intestinal - hepático.

De acuerdo con el método anterior (lin, etc., 2020), en el ciclo de microcanal de 2oc, se realiza un cocultivo utilizando un medio de ciclo de 600 ul y un medio de cultivo de 400 ul situado en la parte superior de la barrera.

El medio de cultivo en la Cámara del hígado se cambia una vez al día y se recoge y reemplaza la mitad del superlíquido circulante. Al final del cocultivo de siete días, se utilizó el método de inmunofluorescencia para analizar los marcadores funcionales específicos de los órganos del hígado. Establezca la bomba de microflujo en la placa a una frecuencia de 0,8 hz.

2,5. Integridad de los órganos intestinales

La resistencia transendotelial (teer) y el coeficiente de permeabilidad aparente intestinal (papp) se midieron en diferentes momentos para evaluar la integridad de los organoides intestinales, tanto de Luciferina sódica como de 40 KDA de Isotiocianato fluorescente de Luciferina - glucano. Los métodos se incluyen en la información complementaria.

2,6. Evaluación del rendimiento de los organoides hepáticos

En el modelo hepático, se seleccionó un sensible método de determinación de la vitalidad celular fluorescente bicolor para distinguir entre células vivas y células muertas. El uso de calcio, amarillo, verde, Luciferina am (un colorante permeable celular) como indicador de células vivas y el uso de yoduro Bobo - 3 (invitrogen company) como indicador de células muertas. Los componentes celulares vivos producen una fluorescencia verde fuerte y uniforme en las células vivas (488 nanómetros / 515 nanómetros estimulados / emitidos), y los componentes celulares muertos producen principalmente fluorescencia roja nuclear (570 nanómetros / 602 nanómetros estimulados / emitidos). Se midieron varios biomarcadores en el líquido sobrenadante obtenido utilizando el modelo de chip de órgano hepático establecido. Evaluamos los niveles de albúmina (alb), urea (urea), Aspartato transaminasa (ast) y Alanina transaminasa (alt), indicadores del metabolismo y daño hepático. El contenido de trifosfato de adenosina (atp) se midió con cell Titor GLO 3D (promega), según las instrucciones del fabricante. El ácido biliares acil - lisina - Luciferina (clf) es un ácido biliares marcado por Luciferina y su comportamiento biológico es muy similar al de la Glicina biliar natural. Para visualizar los conductos biliares en un modelo hepático tridimensional, preparamos una reserva de clf de 20 micromoles y incubamos el modelo a 37 ° C durante 2 horas. Teñir con Hoechst 33342 e incubar durante 10 minutos. Las células se enjuagaron tres veces con un medio de cultivo rojo sin fenoles y se detectaron señales fluorescentes a una longitud de onda de excitación / emisión de 498 / 517 nanómetros.

2,7. Morfología e inmunotinción

Como se mencionó anteriormente (sun y otros, 2024), las rebanadas iguales del intestino y el hígado se fijan con poliformaldehído y se deshidratan con una solución de sacarosa. Las secciones congeladas se cortan antes de teñir con hematoxilina - enrojecimiento (he), ácido periodónico - Schiff (pas) o inmunotinción. Para la inmunotinción, las secciones se enjuagaron tres veces con PBS para tratar las células con PBS que contenían un 0,5% de Tritón X - 100 (salbo), el tiempo de tratamiento y la perforación fueron de 10 minutos, y se cerraron con suero de cabra (beyotime biotechnology) durante 30 minutos, a temperatura ambiente. Añadir un antígeno a cada agujero con una cierta dilución de acuerdo con las instrucciones y incubarlo a 4 ° C durante la noche. Se utilizan los siguientes antígenos: anticoludina (91131s, cst, dilución 1: 400), anti Zo - 1 (ab221547, abcam, dilución 1: 100), anti - MRP2 (ab172630, abcam, dilución 1: 500) y anti - PGP (número de artículo 25081 - 2 - ap, proteintech, dilución 1: 500). Limpiar las células, procesarlas con el correspondiente dígito de antígenos de acoplamiento fluorescente y localizarlas conjuntamente con dapi (beyotime biotechnology). Observar la morfología del campo de visión claro y las secciones utilizando un analizador de imágenes celulares de alta connotación o un microscopio (olimpo ix71). Para la tinción inmunofluorescente in situ, los modelos de membrana intestinal e hígado 3D se enjuagaron tres veces con PBS y se fijaron durante 30 minutos con un 4% de poliformaldehído. A continuación, la muestra se perforó durante 10 minutos en un PBS que contenía un 0,5% de Tritón X - 100 (salbo) y se cerró a temperatura ambiente con suero de cabra (beyotime biotechnology) durante 30 minutos. Según las instrucciones, los anticuerpos in situ diluidos se añaden a cada agujero con una cierta dilución y se incuban a 4 ° C durante la noche. Los anticuerpos in situ utilizados incluyen: anticocludin (91131s, cst, dilución 1: 400), anti - Zo - 1 (sc - 33725, Santa Cruz biotechnology, dilución 1: 500), anti - MRP2 (ab172630, abcam, dilución 1: 500), anti - abcb11 / bsep (ab255605, abcam, dilución 1: 100), anti - PGP (cat no. 25081 - 2 - ap, proteintech, dilución 1: 3a4 (ma5 - 17064, thermosher, 1 dilución: 1000), anti - ki67 (9449s, cst, dilución 1: 10000), anti - cd31 (3528s, cst, dilución 1: 100), anti - cd68 (ab213363, abcam, dilución 1: 100), anti - SMa (14395 - 1 - ap, proteintech, dilución 1: 100), anti - lisado Caspasa - 3 (9664s, cst, dilución 1: 400) y anti - 53 (2524s, dilución cst, dilución 1: 2000). Las células son lavadas, incubadas con anticuerpos secundarios acoplados a la fluorescencia y co - localizadas con dapi (beyotime biotechnology). Los anticuerpos secundarios utilizados incluyen: IgG anti - conejo de cabra H & L (alexa fluor ® 488) (ab150077, abcam, diluido 1: 1000), IgG antirata de cabra (h + l) (alexa fluor ® 555 concurate (4417, cst, diluido 1: 1000) y cabra IgG antiratón H & L (alexa fluor ® 488) (ab150113, abcam, diluido a 1: 1000). Los resultados fueron evaluados por análisis de alto contenido y microscopía fluorescente.

2,8. Determinación de la toxicidad farmacológica y la vitalidad celular

Como se mencionó anteriormente (sun y otros, 2024), se utilizó Cell Titor GLO para detectar la vitalidad celular y medir la supervivencia celular y la supervivencia celular (%). En la placa de 96 agujeros, las células se inocularon en la placa de 96 agujeros con una densidad de 1 × 10 - 4 células por agujero; Al día siguiente, descartar el sobrenadante y cultivarlo con acetaminofén (4 mmol). Se utilizó el mismo método para determinar la supervivencia de la esfera. La prueba se realizó con un fotómetro.

2.9. Proceso oral simulado de aspirina en un chip de cocultivo

Se cargaron siete modelos de 2oc, de los cuales cuatro microcanales recibieron acetaminofén (apap) y el resto No. Para simular el proceso oral y las consecuencias de la toxicidad hepática inducida por apap, al día siguiente de cargar el circuito de 2oc, se añadieron 400 microslitros de apap de 10 mmol a la parte superior del insercivo. A las 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 32 y 48 horas se recogieron 10 microlitros de líquido claro superior para el análisis cuantitativo por cromatografía líquida. 48 horas después de la administración, se recogió el líquido sobrenadante para la medición de varios biomarcadores para evaluar la resistencia a la penetración cutánea (ter). Al mismo tiempo, se recolectaron esferas hepáticas para la evaluación de la toxicidad hepática. También recogimos al menos 3 - 5 para la determinación de la vitalidad celular y el resto se trasladó a una placa de 96 agujeros para su conservación para la tinción fluorescente.

2.10. Evaluación de la toxicidad hepática del chip de cocultivo

La vitalidad celular y los niveles de albúmina (alb), asparato aminotransferasa (ast) y Alanina aminotransferasa (alt) se midieron de acuerdo con el Protocolo de Kit recomendado para evaluar el daño hepático 48 horas después de la administración del medicamento. El potencial de membrana mitocondrial se determinó utilizando un kit de detección de potencial de membrana mitocondrial (beyotime biotechnology, c2001s). El modelo de hígado incrustado en 3D del chip 2oC fue transferido a una placa de 96 agujeros. Las señales fluorescentes de tetrametilrodamina etoxilato (tmre) y Hoechst 33342 se detectaron en nanopartículas EX / EM = 550 / 575 y 350 / 461, respectivamente. El estrés oxidativo se determina utilizando el reactivo de estrés oxidativo cellrox (tecnología Semer fischer, c10444). El modelo de hígado integrado 3D del chip 2oC se transfiere a una placa de 96 agujeros. Las señales fluorescentes de cellrox y Hoechst 33342 se detectaron a 485 / 520 nanómetros y 350 / 461 nanómetros, respectivamente. Las señales Ki - 67 in situ, Caspasa - 3 lisas y 53 se detectaron mediante Tinción inmunofluorescente para evaluar la capacidad de proliferación celular y la apoptosis celular.

2.11. Cuantificación de la muestra

Las concentraciones de acetaminofén (apap) se miden mediante el método anterior (marin y otros, 2019) mediante el método de fase líquida de alto rendimiento (clar) (shimadzu, LC - 2040c 3d). La Cámara lateral Basal (cámara hepática) se llena con un medio de cultivo fresco, mientras que la Cámara lateral superior está expuesta al medio de cultivo de acetaminofén. En cada momento, como se indica en la sección 2.9, se toman muestras de 10 microlitros de cada lado. Se seleccionó el metanol como precipitante de proteínas y, después de agregar 30 microlitros de metanol para precipitar la proteína, se eliminó el precipitado a través de una centrifugadora (13000 rpm, 4 ° c, 15 minutos). Utilice una columna de C18 sostenible inerte (150 mm de longitud, 4,6 mm de diámetro interior, 5 micras de tamaño de partícula, shimadzu). Se utilizan dos fases móviles: el disolvente a (metanol) y el disolvente b (agua destilada), con un caudal de 0,8 ml / min. La composición del disolvente es del 5% a en 0 - 4 minutos, del 5 - 100% a en 4,01 - 10 minutos y del 5% a en 10,01 - 15 minutos. la cantidad de muestra es de 10 microlitros y la detección utiliza un detector de matriz de fotodiodos (pda) (longitud de onda 280 nanómetros). La concentración de acetaminofén se determina utilizando la curva estándar. Los parámetros farmacocinéticos se ajustaron en Phoenix winnonlin (certara, Estados unidos) utilizando un modelo no atrial (nca). Utilizando el método de inserción lineal trapezoidal lineal como método de cálculo, el tipo de modelo se define como plasma y la opción de dosis se define como extravascular. Los datos de concentración - tiempo del acetaminofén (apap) en los compartimentos hepáticos, determinados por Cromatografía líquida de alto rendimiento, se ajustaron para determinar el área bajo curva (auc) a las 0 a 48 horas. La concentración máxima (cmax) y el tiempo de pico (tmax) se leen directamente de la curva de concentración y tiempo individual (superior, 2022; Wang y otros, 2022). La señal de napqi se detecta mediante espectrometría de masas en tándem de Cromatografía líquida de ultra alta eficiencia (uplc - ms) (zhang, etc., 2018). Se prepara una solución de reserva con una concentración de 1 mg / ML disolviendo en metanol la n - Acetil - HIDROQUINONA (napqi) (mce, HY - 66005) y diluyéndola aún más con metanol a una solución de trabajo de 1 microgramo / ML. Se analizó la formación del napqi. Las pruebas se realizaron a las 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 32 y 48 horas después de la administración de acetaminofén (apap) mediante un método de espectrometría de masas líquidas de ultra alta resolución (uplc - ms) equipado con el sistema AB sciex LC ac, detector PDA e instrumento triple tripolar 6600 +. La separación cromatográfica se logró mediante el uso de la columna de aguas acquity uplc Beh C18 (2,1 mm x 50 mm). 1,7 micras). La solución de elución utilizada es una solución acuosa de ácido fórmico (a) del 0,1% (relación de volumen) y un metanol (b), que se separan mediante un procedimiento de elución gradiente, como se muestra en la tabla s1. El caudal de la Cromatografía líquida de ultra alta eficiencia es de 0,3 ml / min, y el análisis de la espectrometría de masas de la Cromatografía líquida de ultra alta eficiencia utiliza 10 microlitros de muestras. Los pares de iones correspondientes al potencial de despolimerización, la energía de colisión, la distribución de la energía de colisión y la temperatura se caracterizan por M / Z 149,98 - 108,04 (30, 30, 15 y 350), lo que corresponde al napqi.

2.12. Análisis estadístico

Las variables continuas se expresan como media ± desviación (desviación estándar). Se utilizó la prueba t de estudiantes de doble cola para estudiar las diferencias entre dos muestras independientes. El análisis de datos se llevó a cabo utilizando la versión 25 de IBM SPSS Statistics (ibm company). El modelo de regresión lineal se realiza con SPSS y graphpad Prism 7.00 (software graphpad). La significación estadística se estableció en P ≤ 0,05.

3. resultados

3.1. Cultivo de organoides

La mezcla celular fue inoculada en placas de cultivo de transwell a una densidad de 1 × 10 - 6, 5 × 10 - 5 y 2,5 × 10 - 5 células / poros para obtener un modelo intestinal in vitro. La resistencia transepitelial (teer) alcanzó los 300 Omega cm2 en 21 días en todos los grupos, de los cuales el Grupo de cocultivo de alta densidad alcanzó los 300 Omega cm2 en 12 días (figura 1a). En el día 14, tanto la Luciferina sódica como el glucano de Luciferina cumplieron con los requisitos de la prueba de permeabilidad en el modelo del Grupo de cocultivo de alta densidad (figura 1b). Cuando la resistencia transepitelial alcanza los 200 - 1000 Omega cm2, la monocapa Caco - 2 puede considerarse completa (iftikhar, etc., 2020). En experimentos posteriores, se seleccionó un grupo de cocultivo de alta densidad para formar una barrera intestinal. Las proteínas de unión estrecha occludin y Zo - 1 fueron teñidas para mostrar su integridad en condiciones de cultivo de equivalentes intestinales. En los días 7 y 21 observamos la estructura continua de la red de occludin (figura 1c), mientras que en las rebanadas de los días 14 y 21, occludin y Zo - 1 mostraron una estructura reticular (figura 1d, figura s1a), lo que indica que la barrera intestinal se consideró completa en el día 14. En los días 14 y 21, los transportistas MRP2 y PGP se distribuyeron en un lado de la sección intestinal (figura 1e, figura s1b), lo que indica la Polar del modelo intestinal. En general, los resultados mostraron que el equivalente intestinal obtenido en el día 14 tenía una estrecha conexión y polaridad; Por lo tanto, la barrera intestinal se consideró madura a los 14 días y se utilizó para más experimentos. En la figura 2a, el diámetro del Modelo aumenta rápidamente en 10 días y se estabiliza en unos 400 micras. La Tinción he mostró que no hubo núcleos necróticos significativos en el día 7 (figura 2b), pero hubo núcleos necróticos leves o varias Apoptosis celular en el día 10 (figura 2b) y áreas necróticas centrales graves en el día 14 (figura s1i). Coincidiendo con la distribución de células muertas mostrada por la Tinción de células vivas / muertas (figura 2c), se detectaron más células muertas en el día 10. La cantidad total de ATP en el modelo continuó aumentando (figura s1c), mientras que la secreción de Lactato deshidrogenasa (ldh) no aumentó significativamente (figura s1d). El modelo creció de manera estable y el número de células necróticas aumentó a medida que se prolongó el tiempo de cultivo, y las células necróticas internas no pudieron detectarse mediante la detección de niveles de LDH en el sobrenadante. Para evitar la formación de núcleos necróticos, estos resultados sugieren que el tiempo de cultivo está limitado a 7 días. En los días 7 (figura 2d) y 10, las señales fluorescentes de las células endoteliales de la vena umbilical humana T1 (huvec - t1), los macrófagos alveolares humanos thp - 1 y las células estelares del hígado humano hhsc fueron rastreadas por inmunofluorescencia, respectivamente.

La figura s1g muestra que los tres tipos de células mencionados permanecen en la esfera el día 10.En el día 7 se detectaron los transportistas mrp2, pgp y bsep (figura 2e) y se rastreó la función de la descarga de ácidos biliares a través de una sonda fluorescente clf (figura s1h). El clf es un sustrato del MRP2 y del bsep (boaglio, entre otros, 2010), y las señales del clf también indican el funcionamiento de estos transportistas en organoides. Finalmente, la tinción pas muestra depósitos de glucógeno (figura 2b), y la tendencia al alza de ALB y urea indica que la función anabólica total del hígado no se ve obstaculizada incluso en situaciones de emergencia por muerte celular (figura s1e - f). Estos resultados sugieren que los efectos de los organoides en la función hepática fueron relativamente estables a los 14 días.

3.2. El establecimiento y la función del chip intestinal - hepático

A los catorce días del establecimiento del modelo intestinal, el intestino y 50 organoides hepáticos se cargaron en compartimentos separados para formar un modelo de chip intestinal - hepático. Los compartimentos interconectados permiten que el líquido circule en los canales y cámaras, facilitando el cocultivo de dos tipos de órganos. El sistema de 2oC se mantuvo durante 7 días. La figura 3 resume la vitalidad celular in vitro y la función intestinal e hepática después del establecimiento del modelo de 2oc. Monitorizamos los niveles de ter (figura 3a) para evaluar el mantenimiento de la barrera intestinal, que, pese a las fluctuaciones, se mantuvo siempre por encima de los 300, lo que indica que la integridad de la barrera intestinal se mantuvo incluso en cocultivo con cantidades iguales al hígado. Durante el cultivo se midieron los niveles de los indicadores de función hepática ALB (figura 3b) y urea (figura 3c) en la Cámara hepática. Los niveles de ALB aumentaron en los tres primeros días y luego disminuyeron, mientras que los niveles de urea no cambiaron significativamente. Además, se evaluaron los niveles de ldh, AST y Alt para determinar la vitalidad celular de los organoides intestinales y / o hepáticos (figuras 3E y f). Los niveles de Lactato deshidrogenasa (ldh) aumentaron ligeramente en ambas cámaras, mientras que los niveles de asparato aminotransferasa (ast) y Alanina aminotransferasa (alt) aumentaron a medida que el tiempo de cultivo se prolongó. Estos resultados sugieren cambios en la función y la vitalidad celular dentro del sistema de 2oc, lo que sugiere una disminución inesperada de la función y la vitalidad celular de los órganos hepáticos en general, a pesar de mantener la integridad de los organoides intestinales. A continuación, se compara la señal de inmunotinción de los organoides hepáticos obtenidos del chip 2oC y la placa de 96 agujeros en el fondo u (figura 3g). En primer lugar, cuando se cultivó en la placa inferior u, se observó principalmente que la señal ki67 se distribuía a lo largo del borde de la esfera y se distribuyó uniformemente dentro de la esfera, aunque su intensidad fue débil siete días después del cultivo total del chip 2oc. Cuando se cultiva en la placa inferior de la u, las señales pgp, MRP2 y bsep a lo largo del borde de la esfera hepática son más fuertes y también se pueden detectar en el interior de la esfera. Después de un total de 7 días de cultivo en el chip 2oc, se observó una fuerte señal de proteína de transporte a lo largo del borde, y la intensidad de la señal de pgp y MRP2 fue ligeramente más fuerte que la señal cultivada en la placa inferior U. Finalmente, a partir de dos métodos de cultivo, la señal del citocromo P450 (cyp) 3a4 se dispersó en la esfera y la señal del modelo 2oC aumentó ligeramente. Estos resultados describen las funciones básicas de los organoides hepáticos y muestran que la expresión de ki67, pgp y MRP2 en la esfera hepática en el chip 2oC es diferente a la que se encuentra en la placa inferior de la U.

3.3. Evaluación de la toxicidad del exceso de acetaminofén en el chip de órganos binarios de 2oC

Antes de probar el chip de 2oc, las células hepg2 y Caco - 2 fueron expuestas a diferentes concentraciones de acetaminofén (apap) durante 48 horas. Cuando la concentración superó los 16 mmol, se observó una fuerte disminución de la supervivencia de las células Caco - 2 (figura s2a), mientras que cuando la concentración de apap superó los 2 mmol, la tasa de inhibición de las células hepg2 superó el 20% (figura s2a). Estos resultados sugieren que puede producirse una toxicidad hepática fuerte en el rango de apap de 2 - 16 mmol, pero no se detectaron efectos tóxicos significativos en las células Caco - 2. En los organoides hepáticos, la tasa de supervivencia celular cayó por debajo del 80% cuando la concentración superó los 2,5 mmol (figura s2b), y 48 horas después del tratamiento con apap de 4 mmol, la tasa de supervivencia de los organoides hepáticos se midió en 70,69 ± 26,97%, en línea con la clara tendencia tóxica observada en las células hepg2. Sobre la base de estos resultados, se seleccionó la dosis para realizar nuevas pruebas en los organoides intestinales. Para alcanzar una concentración final de 4 mm, se aplicó un apap de 10 mm desde el lado superior durante 48 horas y se midieron la supervivencia y el teer para evaluar la vitalidad y la función de barrera de las células intestinales. En comparación con el Grupo control, la vitalidad celular no disminuyó significativamente después de la administración del medicamento (figura s2c). A pesar de la tendencia a la baja mostrada por teer (figura s2d), se mantuvo por encima de 300 Omega cm2, cumpliendo con los requisitos de integridad de la barrera intestinal. Estos resultados sugieren que el apap es citotóxico significativo para las células hepáticas, pero no daña la función de barrera intestinal a las concentraciones detectadas. En el chip de 2oc, se añadieron compartimentos superiores que contenían organoides intestinales maduros a una concentración de 10 milimoles de aspirina (apap). A las 48 horas, la Cámara lateral basal mostró una tasa de supervivencia del 83,94% por esfera, ligeramente superior a la de la placa inferior u (70,69%). Aunque no se encontraron diferencias significativas en la resistencia transepitelial (teer) (figura 4a). Entre ambos grupos, los niveles de AST (figura 3b) (p < 0,05) y Alt (figura 3c) mostraron una tendencia al alza en comparación con el Grupo control, mientras que los niveles de ALB disminuyeron después de 48 horas de tratamiento (figura 3d). Ast, alt y ALB reflejan daño hepático, mientras que los niveles de TER no reflejan la gravedad del daño de barrera intestinal.

Finalmente, detectamos cambios en la señal fluorescente después del procesamiento apap. La señal ki67 detectada refleja un cambio en la capacidad de proliferación celular (figura 4e). En el Grupo control, la señal ki67 se concentró principalmente en los lados y se observó una señal dispersa dentro de la esfera. En comparación con el Grupo control, la señal ki67 después del tratamiento se volvió poco significativa en el lado y la señal se concentró principalmente en el interior, lo que puede deberse a que las células ultraperiféricas estuvieron expuestas al acetaminofén (apap) durante más tiempo que las células internas, lo que aumentó la inhibición de la proliferación celular. A continuación, se detectaron niveles de cellrox y se observaron señales más fuertes en el Grupo apap (figura 4f). La apoptosis celular inducida por apap se observó en una esfera hepática y se utilizó inicialmente tmre para evaluar el potencial de membrana mitocondrial (figura 4g). En el Grupo apap, la intensidad de la señal lateral disminuyó, mientras que en el grupo control la distribución de la señal fue más uniforme, lo que indica que después de la administración de apap, el potencial de membrana mitocondrial de las células laterales dentro de la esfera disminuyó. 48 horas después de la incubación en un chip de 2oc, las expresiones de Caspasa - 3 (figura 4h) y 53 (figura 4i), que se agrietan por la proteína apoptótica en el Grupo de pancreatitis aguda (apap), mostraron una mayor señal de Caspasa - 3 agrietada y una ligera mejora de la señal de 53. Estos resultados sugieren que 48 horas después de la incubación en un chip de 2oc, se puede detectar la inhibición de la proliferación, el estrés oxidativo y la apoptosis de las esferas hepáticas inducidas por la pancreatitis aguda.

3.4. Absorción y metabolismo de fármacos en chips de órganos binarios de 2oC

Las figuras 5a y b muestran la evolución de la concentración del medicamento en cada cámara con el tiempo. Se observó una rápida disminución de la concentración de acetaminofén en la Cámara intestinal (figura 5a), mientras que la concentración del fármaco detectada en la Cámara hepática aumentó en consecuencia (figura 5b). A las 24 horas, se detectó acetaminofén en las cámaras intestinal e hepática de 3,93 ± 0,46 mm y 3,68 ± 0,41 mm, respectivamente. Aunque el proceso de absorción es fácil de observar, el proceso metabólico no es fácil de simular, lo que se puede ver en una disminución no significativa de las concentraciones de acetaminofén, que puede deberse a una dosis excesiva del medicamento. Incluso si la concentración total de medicamentos muestra una tendencia a la baja (figura 5c), la tendencia a la baja no se debe solo al muestreo o al metabolismo de los medicamentos. Calculamos el total teórico de acetaminofén sin metabolismo en 48 horas haciendo referencia a la concentración medida en 32 horas. Cuando no hay metabolismo celular, la cantidad de acetaminofén debe ser de 3,16 ± 0,53 moles; Sin embargo, la cantidad real detectada fue de 2,95 ± 0,20 moles. Estos resultados sugieren que incluso si el medicamento es excesivo, el uso de nuestro chip de 2oC puede simular los procesos de absorción y metabolismo del medicamento. A continuación. Detectamos el metabolito tóxico napqi, que no se detectó en el sobrenadante. Para describir con precisión el proceso de absorción de fármacos en el chip de 2oc, utilizamos el modelo NCA para calcular los parámetros cinéticos de absorción de fármacos del acetaminofén (apap). Los valores de TMAX (tiempo pico), cmax (concentración máxima) y AUC (área bajo curva) calculados fueron de 24 ± 11,31 h, 3,98 ± 0,59 mm y 157,73 ± 14,88 h, respectivamente. Sin embargo, debido a la disminución mínima de la concentración de apap, es difícil ajustar los parámetros cinéticos de eliminación de fármacos.

4. debate

Este estudio utilizó una plataforma de chip multiorgánico intestinal - hepático in vitro para evaluar la absorción de medicamentos y predecir la Farmacodinámica y sus efectos tóxicos. Construimos un sistema de chips enterohepáticos acoplando dos órganos independientes en una plataforma de chips multiorgánicos de 2oC para reproducir la absorción continua de fármacos del acetaminofén oral (apap) y las lesiones hepáticas agudas resultantes. En el sistema de 2oc, la tasa de absorción y los efectos tóxicos de apap son consistentes con los procesos de tratamiento in vivo conocidos. Estos resultados sugieren que el proceso de absorción se puede simular en nuestro modelo de 2oC y que se pueden detectar efectos tóxicos en presencia de órganos intestinales aguas arriba, lo que es consistente con informes anteriores. Nuestros hallazgos apoyan el uso futuro de modelos de chips de múltiples órganos acoplados a múltiples órganos como modelos auxiliares para la predicción de toxicidad farmacológica. Construcción intestinal con células Caco - 2 y ht29 - mtx - E12 basadas en la proporción de células epiteliales intestinales medias del intestino delgado humano con células de Copa (chen, etc., 2017; Tsamandoulas, entre otros, 2017). Creación de esferas hepáticas basadas en la proporción de componentes celulares en un hígado sano (weiler - normann y rehermann, 2004). Sobre la base de estudios anteriores, detectamos la estructura y la función hepática en un cocultivo de dos semanas. Las señales de los marcadores thp - 1 inducidos por huvec - T1 y cd31 (newman, 1997), cd68 (gao, etc., 2018) y alfa - SMa (chiotto, etc., 2021) de hhsc indican la distribución celular tras 10 días de cocultivo. La acumulación de insuficiencia hepática crónica (clf) (hopwood, entre otros, 2006), los transportistas mrp2, bsep y PGP (rendic, 2021) y el aumento de los niveles de albúmina (alb) y urea (urea, entre otros, 2020) explican, respectivamente, la mejora de la función de transporte de bilis, la función de expulsión de fármacos y la función anabólica. La insuficiencia hepática crónica se acumula en la estructura tubular de la esfera 3D (ramaiahgari, entre otros, 2014), una señal que indica la formación de una estructura tubular inicial siete días después del cultivo. Construimos un chip intestinal - hepático basado en nuestro órgano intestinal e hepático (marin y otros, 2019; Maschmeyer, entre otros, 2015). Otros modelos intestinales - hepáticos indican que la superficie y la capacidad metabólica de los órganos influyen en la absorción y metabolismo de los fármacos orales (lee, entre otros, 2017). La toxicidad hepática se evalúa con asparato aminotransferasa (ast) y Alanina aminotransferasa (alt) (meinier y larrey, 2019). Después de tres días de cocultivo, su tendencia al alza indica la presencia de daño potencial a las células hepáticas, mientras que la tendencia a la baja de la albúmina (alb) puede deberse a un suministro nutricional insuficiente, administración de medicamentos, desnutrición, disminución de la ingesta de proteínas y daño hepático (belinskaia, etc., 2020; Meinier y larrey, 2019). En este estudio, la señal del cyp3a4 aumentó ligeramente, en línea con los resultados de estudios anteriores, lo que sugiere que la actividad del cyp3a4 se incrementó después del cocultivo intestinal - hepático (chen y otros, 2018 b; Shinohara y otros, 2021).

Debido a que estudios anteriores se centraron principalmente en el aumento de la actividad metabólica de los organoides hepáticos después del cocultivo intestinal - hepático (shinohara y otros, 2021), nos centramos en los transportistas mrp2, pgp y bsep, que median la eliminación de sustancias exógenas de las células hepáticas (jetter y kullak - ublick, 2020). Nuestros resultados demuestran claramente que el modelo de 2oC es capaz de simular la absorción de peligros tóxicos después de la administración oral y que el sobrenadante es fácil de conservar para su uso en el monitoreo de biomarcadores humanos.

Las razones para elegir esta concentración son las siguientes: 1) bajo la concentración de prueba, la integridad de la barrera intestinal no se dañará; 2) el medicamento tiene un efecto tóxico más alto en el hígado que en el intestino. Aunque la absorción del acetaminofén (apap) se ve afectada en gran medida por el vaciado gástrico (toes, etc., 2005), se absorbe principalmente por difusión pasiva del intestino delgado proximal (m 'eza' ros, etc., 2022). In vitro, se ha demostrado que las altas concentraciones de apap reducen la vitalidad de las células hepáticas (bell y otros, 2020). A dosis bajas, el apap mostró efectos tóxicos limitados; Sin embargo, en caso de sobredosis o abuso de drogas, el apap puede causar daños agudos y graves en las células hepáticas (buncherntavakul y reddy, 2018). La relación entre las concentraciones de exposición y los efectos tóxicos a lo largo del tiempo puede explicar el riesgo de toxicidad dependiente del tiempo y los mecanismos moleculares de los productos químicos (tennekes y Sánchez - bayo, 2013). La concentración de apap es crucial para reflejar la exposición al medicamento; Así, detectamos el transbordo de apap (bessems y vermeulen, 2001; Krenkel y otros, 2014; Makin y williams, 1996).

El acetaminofén (apap) tiene una buena biodisponibilidad oral (88%) al ser bien absorbido y alcanzar picos de concentración plasmática en los 90 minutos posteriores a la ingesta (hodgman y garrard, 2012). En nuestro estudio, la predicción de TMAX en nuestro modelo de 2oC (24 ± 11,31 h) fue superior a los resultados de los datos clínicos (0,33 - 4 h) y otros chips de 2oC (6 h) (marin y otros, 2019). El apap se absorbe rápidamente a dosis terapéuticas y se ralentiza a medida que aumenta la dosis (rosenberg, entre otros, 1981). A dosis terapéuticas, la semivida plasmática de apap oscila entre 1,5 y 2,5 horas; Sin embargo, detectamos un equilibrio de concentración de fármacos en ambas cámaras después de 24 horas, en línea con los resultados de estudios anteriores. Rawlins y otros (1977) midieron las concentraciones plasmáticas de los voluntarios después de la administración oral de apap (500, 1000 y 2000 mg), y los resultados mostraron un retraso de TMAX a 2000 mg. Algunos informes de casos muestran que la sobredosis de preparaciones de apap puede causar retrasos en los picos de concentración plasmática y prolongación de la absorción de apap (chiew, etc., 2010; Graudins, etc., 2010; Roberts y buckley, 2008). Mazaleuskaya y otros (2015) concluyeron que la semivida se prolongó a 4 - 8 horas debido al daño metabólico causado por el exceso de apap. Se ha seleccionado una dosis de toxicidad hepática no enterotóxica con una concentración administrada (acetaminofén, 4 mmol, 604,64 mg / l) de aproximadamente cuatro a seis veces la concentración plasmática envenenada (100 - 150 mg / l) y de dos a tres veces la concentración plasmática letal en coma (200 - 300 mg / l) (schulz, etc., 2020). Debido a que las concentraciones tóxicas de acetaminofén in vitro (bell y otros, 2020) superan con creces las concentraciones plasmáticas terapéuticas en humanos (5 - 25 mg / l) (schulz y otros, 2020), en nuestro estudio no se observó un proceso significativo de eliminación de fármacos en 48 horas. La evidencia auxiliar de la Farmacodinámica (pk) sugiere que el modelo de chip necesita ser modificado aún más, especialmente para estudiar más a fondo los métodos de conversión de datos in vitro y clínicos a clínicos para mejorar la correlación entre los resultados in vitro y clínicos.

Finalmente, detectamos la toxicidad de nuestro equipo en las células esféricas del hígado. La tasa de supervivencia de las células esféricas en el chip de 2oC aumentó ligeramente en comparación con la placa de 96 agujeros, lo que refleja específicamente los cambios en la toxicidad del medicamento con la concentración del medicamento y la exposición al tiempo. La ingesta excesiva de acetaminofén (apap) aumenta significativamente los niveles séricos de asparato aminotransferasa (ast) y Alanina aminotransferasa (alt) (acheampong y thomas, 2016; Stockman， 2008); Sin embargo, después de 48 horas de exposición en el modelo de 2oc, los niveles de AST y Alt aumentaron ligeramente. Al mismo tiempo, la reducción de la ALB indica una inhibición de la función metabólica del hígado y una grave lesión hepática. Esta caída es consistente con un informe anterior (wu, etc., 2022). Después de la entrega del medicamento, la señal ki67 (necesaria para la División celular) de las células ultraperiféricas disminuyó, lo que indica que la proliferación de las células ultraperiféricas fue inhibida. Inicialmente, detectamos esferas hepáticas bloqueadas después del tratamiento de la pancreatitis aguda.

A dosis terapéuticas, el acetaminofén se convierte principalmente en metabolitos no tóxicos a través de la glucurónida y la sulfatación. El acetaminofén es oxidativo y activado por la enzima cyp2e1 como un producto tóxico, el inhibidor de la n - acetilasparasitasa (napqi). El napqi agota el GSh y lo convierte en Cisteína de acetaminofén. Cuando el GSh está por debajo del 30% de los niveles normales, el napqi ya no se reduce, provocando reacciones tóxicas. Aunque se puede detectar napqi (russomano, etc., 2023) en suero y órganos animales; Zhang y otros, 2018), pero además en las células hepáticas primarias (pingli y otros, 2019), sigue siendo difícil detectar este intermedio inestable en las líneas celulares (zhang y otros, 2020). Como se mencionó anteriormente (zhang y otros, 2020), solo una pequeña cantidad de acetaminofén se convirtió en napqi, y su semivida es extremadamente corta (coles y otros, 1988; Madsen, etc., 2007). Puede desintoxicarse rápidamente y fácilmente en 130 milisegundos mediante la Unión a GSh (coles, etc., 1988; Madsen, entre otros, 2007), o la reducción al acetaminofén (zhang, entre otros, 2020) a través de nadph, dihidroiniamida adenina dinucleotida y reductasa, por lo que es difícil detectar napqi en sus modelos in vitro (zhang, entre otros, 2020). La Unión a la proteína apap se produce después del agotamiento de la gsh, un evento temprano en el mecanismo de toxicidad hepática (jaeschke, entre otros, 2014; Mcgill, etc., 2013). Como modelo in vitro alternativo, agotamiento de GSh (leclerc, etc., 2015), capacidad de oxidación (geib, etc., 2021; Leclerc, etc., 2015), Unión a proteínas covalentes (geib, etc., 2019, 2021; Pierce, entre otros, 2002) y la información de toxicidad in vitro obtenida con modelos de biología de sistemas (leclerc, entre otros, 2015) pueden ser alternativas para rastrear o sugerir la formación y acumulación de napqi. El napqi se une a proteínas mitocondriales para inducir la Acilación de proteínas, lo que puede causar necrosis o estrés oxidativo de las células hepáticas y disfunción mitocondrial, lo que eventualmente conduce a la apoptosis celular y daño hepático (bessems y vermeulen, 2001; Krenkel y otros, 2014; Makin y williams, 1996; Saito y otros, 2010). En la patogénesis de la hepatotoxicidad inducida por la pancreatitis aguda (apap), las células hepáticas presentan disfunción mitocondrial y estrés oxidativo (shan, etc., 2018; Ye y otros, 2018). Después del tratamiento, la disminución de la señal de tmre en el modelo hepático mostró una disminución del potencial de membrana mitocondrial en las células hepáticas, especialmente en las células laterales, y la función mitocondrial se vio afectada. El potencial de membrana mitocondrial indica cambios en la actividad mitocondrial y la destrucción de la homeostasis mitocondrial (vianello y otros, 2023). En las primeras etapas de la insuficiencia hepática aguda, el potencial de la membrana mitocondrial disminuye, lo que provoca cambios morfológicos mitocondriales y afecta la función mitocondrial, que es la señal inicial del daño celular hepático (li y otros, 2011; Umbaugh, etc., 2021). Teniendo en cuenta que el estrés oxidativo causado por la insuficiencia hepática aguda puede dañar el plegado de proteínas y desencadenar el estrés del retículo endoplásmico (ferret, 2001; ye, etc., 2018), utilizamos cellrox para localizar la señal de oxígeno activo y observamos una gran distribución de la señal de oxígeno activo en el Grupo de insuficiencia hepática aguda. Estos resultados sugieren que los cambios en el potencial de membrana mitocondrial y el estrés oxidativo celular se pueden detectar en modelos hepáticos después de simular un exceso de insuficiencia hepática aguda con un chip de 2oc.

La apoptosis de las células hepáticas se produce en las primeras etapas de la insuficiencia hepática aguda (possamai y otros, 2013). La insuficiencia hepática aguda (inducción de apap) puede provocar el agotamiento de la gsh, que desencadena vías y procesos de toxicidad mitocondrial que transforman los precursores de la proteasa de Cisteína aspártica 3 / 7 en proteasa de Cisteína aspártica lisada activa (baek y otros, 2016). La proteasa del ácido aspártico de Cisteína - 3 es un ejecutor clave de la apoptosis celular y su forma de enzima precursora se rompe antes de convertirse en forma activa (fernandes - arnemri, entre otros, 1994). El Gen inhibidor tumoral p53 regula la apoptosis celular a través de la activación transcripcional (arakawa, 2005). La toxicidad hepática inducida por apap puede provocar un ligero aumento del 53 (chen y otros, 2018a). Después de la administración de apap, la señal de proteína de la proteasa triptófana de Cisteína agrietada aumentó significativamente y la señal 53 aumentó ligeramente, lo que indica que apap indujo señales de apoptosis celular.

Sin embargo, es innegable que los modelos animales han contribuido significativamente a la comprensión y el progreso de la medicina moderna, especialmente en las últimas décadas, lo que puede ser insustituible para los modelos in vitro alternativos para la evaluación de la seguridad de medicamentos y productos químicos. Aunque estos nuevos modelos han jugado y seguirán desempeñando un papel importante en la investigación biomédica y regulatoria, permitiendo el estudio de una serie de efectos de una sustancia y proporcionando una alta sensibilidad, sin interferencias de otros fenómenos biológicos (kaplan y otros, 2024). Por otro lado, hay que destacar que el modelo de 2oC ciertamente no ha podido reemplazar el modelo biológico existente, sino que sirve como herramienta de investigación para proporcionar con antelación ideas específicas para reducir el número de animales necesarios para el cribado de fármacos. Nuestros resultados sugieren que el modelo de 2oC puede utilizar sondas fluorescentes para medir la absorción del fármaco y detectar cambios en las señales asociadas a múltiples toxicidades, demostrando la posibilidad de un chip multiorgánico como evidencia auxiliar para detectar simultáneamente la eficacia / toxicidad del fármaco y el potencial farmacodinámico.

5. Conclusiones

Construimos un intestino - hígadoChip de órgano dúplexSistema y evaluar su toxicidad simulando un proceso de lesión hepática aguda después de un exceso de acetaminofén (apap). Los organoides intestinales se establecieron mediante la cocultura de células Caco - 2 y ht29 - mtx - e12, y los organoides esféricos hepáticos se establecieron con células hepg2, huvec - t1, thp - 1 inducidas por PMA y hhsc. En el chipset de múltiples órganos, la expresión de pgp, MRP2 y cyp3a4 en los organoides hepáticos mejoró ligeramente. Después de obtener la curva concentración - tiempo de apap en ambas cámaras, los parámetros farmacocinéticos tmax, cmax y AUC se ajustaron utilizando el método nca. El tratamiento con apap aumentó los niveles de los biomarcadores tóxicos para el hígado, AST y alt, redujo la secreción de albúmina (alb), inhibió la proliferación celular, aumentó la señal de especies reactivas de oxígeno (ros), redujo el potencial de membrana mitocondrial, activó la Caspasa - 3 y mejoró la señal p53. Este estudio proporciona evidencia auxiliar para la aplicación de chips de órganos en estudios de farmacotoxicidad, al tiempo que detecta el contenido del medicamento y las reacciones tóxicas, proporcionando potencial para predecir las propiedades farmacocinéticas y toxicológicas de los compuestos candidatos.